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研究背景：目前认为，通过上调肺泡上皮钠离子通道（ENaC）的表达可以增加Na+的转运，为肺泡液体清除（alveolar fluid clearance，AFC）提供驱动力，减轻肺水肿，从而使急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的患者受益。现已阐明，ENaC主要受mTORC2/SGK-1信号通路的调控。MicroRNA(miRNA)是非编码微小RNA，能够在转录后水平调控其目的mRNA的翻译过程。已有研究发现，miRNA-7-5p参与了肿瘤细胞中mTOR的调控，但是在人肺泡上皮细胞中miRNA-7-5p调控ENaC的机制并不清楚，其能否在ARDS时影响ENaC的表达水平亦未见有报道。 目的：探讨miRNA-7-5p通过mTORC2/SGK-1信号通路对人肺泡上皮钠离子通道的调控机制。再进一步揭示急性呼吸窘迫综合症时人肺泡上皮 miRNA-7-5p的表达变化与其在肺泡液体清除过程中起到的作用。由此丰富 ARDS发病机制的分子生物学理论，并为该疾病的临床治疗提供新的线索。 方法： 本研究由三部分组成 第一部分：双荧光素酶报告基因系统验证miRNA-7-5p靶基因 首先通过重组DNA质粒构建psiCHECK2-mTOR、psiCHECK2-mTOR-mut、psiCHECK2-SGK-1、psiCHECK2-SGK-1-mut共四组mRNA3’-UTR中含有或不含miRNA-7-5p靶序列的重组报告基因。然后通过双荧光素酶报告基因系统分别证实mTOR、SGK-1是否均为miRNA-7-5p的靶基因。 第二部分：miRNA-7-5p调控人肺泡上皮细胞ENaC的机制研究 转染miRNA-7-5p mimic上调肺泡上皮miRNA-7-5p表达水平后，qRT-PCR检测实验各组 miRNA-7-5p、mTOR mRNA、SKG-1 mRNA表达水平，了解miRNA-7-5p对 mTOR mRNA、SKG-1 mRNA的靶作用。再应用免疫印迹法(Western blotting)检测各组mTOR、Total AKT、p-AKT-ser473、SGK-1表达水平，探索 miRNA-7-5p对 mTORC2/SGK-1信号通路活性的调控作用。最后验证miRNA-7-5p对ENaC各亚基表达水平的影响。 第三部分：miRNA-7-5p对LPS诱导下人肺泡上皮细胞ENaC的调控机制研究 使用LPS刺激A549细胞以模拟ARDS时的病理状况，分别在0，3，6，12，24小时利用qRT-PCR检测细胞内miRNA-7-5p的变化情况。使用LPS刺激12小时后，转染miRNA-7-5p inhibitor下调miRNA-7-5p表达，再通过qRT-PCR检测mTOR与SGK-1的mRNA表达水平，免疫印迹法检测各组mTOR、Total AKT、p-AKT-ser473、SGK-1表达水平，探讨抑制 miRNA-7-5p的表达在 ARDS时对mTORC2/SGK-1信号通路活性的调控作用。最后继续应用免疫印迹法、免疫荧光显微镜检测miRNA-7-5p对LPS诱导下ENaC-α、β、γ三个亚基与mTOR、SGK-1的表达影响。 结果： 1.双荧光素酶报告基因系统验证miRNA-7-5p靶基因 通过TargetScan预测发现mTOR与SGK-1的3’-UTR内都有miRNA-7-5p的靶点序列。分别构建mTOR与SGK-1 mRNA3’-UTR中含有miRNA-7-5p靶序列的野生型和突变型报告基因载体，与miRNA-7-5p mimic或miRNA-7-5p negative control共转染A549细胞后进行双荧光素酶报告基因检测发现，miRNA-7-5p对于psiCHECK-2-mTOR的荧光表达有非常显著的抑制作用，相对荧光强度下降至57%±5%(7.11±0.64与12.50±0.99)，与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）；而miRNA-7-5p对psiCHECK-2-mTOR-mut的荧光表达没有明显抑制作用(P＞0.05)。我们还发现在建立的双荧光素酶报告基因系统中，miRNA-7-5p对于psiCHECK-2-SGK-1的荧光表达也具有非常显著的抑制作用，相对荧光强度下降至45%±4%(5.12±0.46与11.49±1.48)，与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）；但是miRNA-7-5p对psiCHECK-2-SGK-1-mut的荧光表达则没有明显抑制作用(P＞0.05)。 2. miRNA-7-5p调控人肺泡上皮细胞ENaC的机制研究 A549细胞分别转染miRNA-7-5p mimic与negative control后，通过qRT-PCR实验我们发现，miRNA-7-5p mimic转染组中mTOR的mRNA表达水平较空白对照组和negative control组出现了明显的降低，其表达水平仅为空白对照组的0.54倍（P＜0.01）；SGK-1的mRNA表达水平较空白对照组和negative control组也出现了明显的降低，其表达水平低至空白对照组的0.30倍（P＜0.01）。接下来通过Western blot实验发现，mTOR与 SGK-1的蛋白表达同样出现了降低(P＜0.01)，同时，mTORC2下游磷酸化产物 p-Akt-Ser473的表达降低(P＜0.01)。这些结果表明，miRNA-7-5p能够在细胞内抑制 mTORC2/SGK-1信号通路的活性。然后应用Western blot检测发现miRNA-7-5p mimic转染组ENaC-α、β、γ三个亚基的表达较空白组均出现了降低(P＜0.01)，这提示 miRNA-7-5p在肺泡上皮细胞内能够通过mTORC2/SGK-1信号通路够抑制ENaC的表达。 3.miRNA-7-5p对LPS诱导下人肺泡上皮细胞ENaC的调控机制研究 发现自100 ng/ml浓度LPS诱导后6小时开始miRNA-7-5p的表达就开始升高（P＜0.05），且随时间推移，其表达呈逐渐上升的改变，分别为LPS诱导开始时的1.4、1.9与2.8倍（P＜0.05）。这说明ARDS时，肺泡上皮细胞内miRNA-7-5p的表达有明显升高。向LPS刺激后的A549细胞分别转染miRNA-7-5p inhibitor与negative control，发现mTOR与SGK-1的mRNA表达水平较LPS组与LPS+negative control组均出现了明显的回升(P＜0.01)。Western blot实验发现，mTOR，SGK-1与 p-Akt-Ser473的蛋白表达也分别出现了升高(P＜0.01)。这些结果表明，降低miRNA-7-5p的表达能够在ARDS时恢复mTORC2/SGK-1信号通路的活性。同时Western blot实验与免疫荧光显微镜成像都证明ENaC亚基表达水平较单纯LPS组均出现了明显的恢复(P＜0.01)。这提示通过降低肺泡上皮细胞miRNA-7-5p的表达能够提高ENaC的稳定性，逆转ARDS时低下的ENaC表达，从而可能起到增强肺水清除的效果。 结论：1. mTOR，SGK-1都是miRNA-7-5p的靶基因。2. miRNA-7-5p能够通过mTORC2/SGK-1信号通路负向调控人肺泡上皮细胞钠离子通道的表达水平。3. ARDS时人肺泡上皮细胞miRNA-7-5p表达升高，抑制miRNA-7-5p的高表达水平能够恢复mTORC2/SGK-1信号通路的活性，逆转人肺泡上皮细胞钠离子通道的表达水平，提示其可能是治疗ARDS的新靶点。