论文部分内容阅读
大肠杆菌是一种重要的人畜共患病原菌,严重危害了公共安全和畜牧养殖业。在细菌中,四（五）磷酸鸟苷酸（p）ppGpp和多聚磷酸polyP是细菌应对压力应激（SR）的重要信号分子。有文献报道,在压力应激过程中,双组份信号系统与（p）ppGpp和Poly（P）存在着直接的联系。为了研究TCS在多聚磷化物调控中的作用,我们利用凝胶迁移实验（EMSA）,基因缺失菌株的构建,荧光定量PCR等试验研究ArcA、OmpR和PhoB对（p）ppGpp的调控机制。取得如下主要结果:1.TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB可以调控relA基因的表达对TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB和relA启动子区进行体外结合实验。发现这三个蛋白都可以阻滞PrelA在非变性蛋白胶上的迁移,这说明ArcA、OmpR、PhoB可以与PrelA结合。同时,对ΔarcA、ΔompR、ΔphoB和野生株PCN033进行相对荧光定量实验,发现缺失株内relA基因表达明显下调。综合说明TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB可以通过与PrelA结合来调控relA基因的表达。2.TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB有助于细菌抵抗压力环境对ΔarcA、ΔompR、ΔphoB和野生株PCN033以低浓度梯度过氧化氢处理,测定生长曲线,发现缺失株对过氧化氢的耐受性都低于野生株;同时,对上述四株菌以高浓度过氧化氢处理,测定细菌存活率,发现缺失株在高浓度过氧化氢中的存活率明显低于野生株。在生物膜形成与分析实验中,发现缺失株中形成的生物膜数量少于野生株PCN033,表明ArcA、OmpR、PhoB可以影响生物膜的形成。上述结果表明TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB有助于细菌抵抗过氧化氢氧胁迫,并可以影响生物膜的形成。3.Poly（P）可以通过TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB来调控（p）ppGpp的合成在（p）ppGpp合成测定实验中,发现缺失株ΔarcA、ΔompR、ΔphoB中（p）ppGpp的合成数量明显低于野生株。另外,当过表达PPK/PPX而使胞内积累/消除poly（P）时,ArcA、OmpR、PhoB的表达也会相应的上调或者下调,表明poly（P）可以调控三者的表达。结合前述,ArcA、OmpR、PhoB可以调控relA基因的表达。综合而言,Poly（P）可能是通过调控TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB的表达来调控relA的表达,从而实现对（p）ppGpp合成的调控。