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原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝癌,据估计,全世界大约有20亿人感染了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV),其中3.5-4亿为慢性乙肝携带者,每年约有60万人死于HBV相关的疾病。据2014年中国肿瘤登记年报报道,我国人群肝癌发病率21.35/10万,排名第四,肝癌死亡率18.43/10万,排第二。HBV感染是HCC发生、发展和复发的主要危险因素,文献报道,HBV基因突变与HCC的发生、发展和复发密切相关。第一部分:基于一代测序的HBV RT/S区突变与原发性肝癌患者预后影响的研究本部分旨在探究HBs Ag阳性HCC患者肝癌组织中HBV RT区突变与患者预后的关系。抽提84对癌组织(TT)和癌旁组织(ANTT)中HBV DNA,采用TaqMan荧光实时PCR定量检测HBV总DNA(HBVtDNA)和共价闭合环状DNA(cccDNA),并对RT区(nt130-1161)进行一代测序。结果发现ANTT HBV RT和S区分别有27和29个氨基酸位点出现突变,突变发生率大于5%。COX多因素分析表明肿瘤直径大于8cm、F221Y突变是肝癌术后复发的2个独立危险因素,HR值分别为2.345(95%CI:1.391-3.953,P=0.001),1.838(95%CI:1.069-3.161,P=0.028)。F221Y也是影响患者总体生存期的独立危险因素之一,HR=2.557(95%CI:1.344-4.866,P=0.004)。根据221位氨基酸是否突变将患者分为突变型组(n=25)与野生型组(n=59),比较两组之间临床特征。突变型组AFP水平高于野生型组,P=0.048。同时,相比野生型组,突变型组患者更易于产生腹水(P=0.037),瘤体更大(直径>8cm,P=0.001)。表面抗原中的sR122K,sT140S,sF183V在TT和ANTT的分布明显存在差异,这三个氨基酸刚好全部位于MHR(major hydrophilic region),即B细胞抗原识别表位。S区sR122K突变型组更倾向于肝癌的复发。结论:RT区F221Y突变是术后HCC复发的2个独立危险因素之一(另一个因素是HCC肿瘤直径大于8cm),F221Y突变同时也是影响患者术后生存期的独立危险因素,并与多个不良临床与实验室指标有关。第二部分:基于二代测序的HBV RT基因变异在原发性肝癌中的临床意义研究这部分采用高通量测序,聚焦hbv相关肝病患者hbvrt区序列,重点关注肝病进展和耐药相关的位点。本研究纳入了慢性乙型肝病(chb)(n=37)和hcc(n=95)共132例,采用illuminamiseq深度测序获取了比前面一代测序分析更全面、复杂的hbv序列信息。二代测序与一代测序、反向杂交法的方法学比较显示,三种方法hbv分型对5/8例一致,另有3例检测被反向杂交法和二代测序方法检测出b,c混合型感染;在耐药突变检测方面:三种方法对5/8样本检测结果一致,两种测序方法的检测结果基本相同。hcc组织中耐药位点的检测提示,antt中的平均突变频率高于tt;在未服用核苷酸类似物(nas)的患者体内也存在低频的耐药突变,如rtl180m,a181t,a202g,m204i/v;chb患者rt区的复杂度无论是核苷酸水平(chb:0.653±0.029,hccserum(hs):0.624±0.038,antt:0.370±0.057,tt:0.344±0.058,p<0.001)还是氨基酸水平(chb:0.493±0.017,hs:0.443±0.021,antt:0.282±0.039,tt:0.262±0.055,p<0.001)均显著高于hcc组织;chb组平均氨基酸突变频率也显著高于hcc组(chb:0.0672±0.0096,hs:0.0553±0.0086,antt:0.0575±0.0218,tt:0.0563±0.0215,p=0.019),进一步配对检验结果显示hcc组antt的突变频率明显高于tt(0.0482±0.0042vs0.0462±0.01102,p<0.001);同时还发现rts53n(or=0.895,p=0.011)、rtd134n(or=0.964,p=0.008)、rti224v(or=0.956,p=0.014)突变的个体倾向于chb,而i91l(or=1.066,p=0.025)、n121i(or=1.108,p=0.045)、l269i(or=1.022,p=0.030)突变是hcc发生的独立风险因素。我们通过二代测序对患者hbv变异检测,可以更加真实和准确地评估患者体内hbv基因组状况,了解hbv种群动态,有利于指导个性化诊疗。第三部分:原发性肝癌患者血清hbcrag与组织中hbvdna载量的关系本部分主要分析一种新型的乙型肝炎感染标志物-乙型肝炎核心相关抗原(hbcrag)及与hcc患者癌组织和癌旁组织内cccdna、总hbvdna水平的关系。收集行肝癌切除术的hbv感染相关的hcc患者95例,用化学发光法检测患者血清hbcrag水平,同时用pcr荧光探针法分别对配对tt和antt内cccdna和hbvtdna进行定量检测。hbeag+/hbeab-组、hbeag+/hbeab+组、hbeag-/hbeab+组hbcrag水平分别为6.41±1.18lgu/ml、5.80±0.50lgu/ml、5.16±0.94lgu/ml,3组间差异有统计学意义(P<0.001)。HBcrAg与ANTT cccDNA和ANTT HBVtDNA具有相关性(r=0.359、0.440,P<0.05);HBeAg与ANTT cccDNA和ANTT HBVtDNA具有相关性(r=0.412、0.417,P<0.05);血清HBV DNA水平与ANTT ccc DNA和ANTT HBVt DNA具有相关性(r=0.560、0.653,P<0.05)。结论HBcrAg可能可以辅助区分发生HBe Ag血清学转换和未转换的患者;在HBsAg阳性HCC患者中,HBcrAg与ANTT HBVt DNA及ccc DNA具有一定的相关性,但其相关性未表现出比现有血清标志物(HBeAg及HBV DNA)更好。综上所述,目前,一代测序及二代测序技术均可用于RT/S基因变异的研究,二代测序技术作为敏感性和准确度好、通量高的技术,可提供更全面、复杂的信息,不仅有利于临床抗病毒耐药位点检测并指导个体化用药,而且我们的研究还发现HBV RT区基因变异与HCC的发生发展、预后的关系密切;新型HBV感染标志物HBcrAg可以辅助区分发生HBeAg血清学转换和未转换的患者,HBcrAg和HBeAg及HBV DNA类似,与ANTT HBVtDNA及cccDNA具有一定的相关性,为临床HBV感染动态检测又提供了一个新的标志物。