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建立猪卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎体外培养技术配套,进一步改善其操作程序、提高其效率,是实现猪胚胎体外生产的关键。目前,猪卵母细胞冷冻保存尚未取得突破性进展,冷冻方案尚待优化。系统研究猪胚胎体外生产与卵母细胞冷冻保存技术,有助于完善胚胎体外生产的技术配套,寻求猪种质资源保存的新途径和有效方法;有助于猪胚胎生物技术研究的实用化,丰富发育生物学文库。因此,具有重要的理论意义和实用价值。本研究以屠宰猪卵巢为材料,旨在通过对猪胚胎体外生产过程中关键技术的研究,建立简便、有效的技术体系,为建立猪胚胎体外生产技术平台奠定基础。 1.猪胚胎体外生产的关键技术研究 本试验以屠宰猪卵巢为研究对象,系统比较了采卵方法、卵巢运输温度、血清、激素、猪卵泡液、卵泡大小和卵巢类型等对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。结果表明,切割法所获卵母细胞数及每只卵巢平均采卵数均显著高于抽吸法,但卵母细胞体外成熟率(43.3%)明显低于抽吸法(75.6%,P<0.05);抽吸法可获得较高的卵母细胞可用率。屠宰猪卵巢运输温度为37℃和25℃时,可分别获得76.7%和80.2%的卵母细胞体外成熟率,52.2%和52.4%的卵裂率及17.7%和18.1%的桑椹胚发育率;当运输温度降为15℃时,成熟率、卵裂率和桑椹胚发育率均表现下降;若降到10℃时,成熟率、卵裂率和桑椹胚发育率仅为44.2%、22.7%和4.55%,显著低于37℃和25℃组(P<0.05)。采用抽吸法采集中型卵泡(直径2~5mm)卵母细胞进行体外培养,结果发现,成熟培养液中无血清添加组,卵母细胞的卵丘扩散率和pbl排出率分别为47.4%和47.8%,均显著低于添加血清的两组(P<0.05)。激素和猪卵泡液(pFF)的添加,对体外成熟和体外受精具有积极作用。在添加激素和pFF的成熟培养液中培养24h后,转入无激素、无pFF培养液中继续培养20h,卵丘扩散率可达85.3%,桑椹胚发育率为17.7%;连续培养对照组的桑椹胚发育率最高,为28.7%。对不同大小卵泡的卵母细胞研究表明,小卵泡卵母细胞发育能力显著低于大、中卵泡卵母细胞(P<0.05)。卵母细胞无论来自黄体卵巢组,还是无黄体卵巢组,其体外发育能力无明显差别(P>0.05)。在精子获能液mTBM液中,单独添加肝素的体外受精效果显著优于咖啡因组和混合添加肝素与咖啡因组。本实验表明,NCSU-23用于培养猪体外