研究目的：研究表明,高迁移率族蛋白1(HMGB1)作为重要的晚期炎症介质在脓毒症、胰腺炎及各种炎症的发生发展中起到重要作用。由于HMGB1是一个肝素结合蛋白,因此本研究旨在考察肝素对HMGB1空间构象的影响；测定肝素与HMGB1、HMGB1与晚期糖基化终产物受体(RAGE)的亲和力,探讨肝素对HMGB1/RAGE亲和力的影响；检测肝素对脐静脉内皮细胞(HUVEC)表面HMGB1与RAGE及TLR4的结合的影响；研究肝素对HMGB1放大LPS炎症活性的抑制作用,探讨肝素可能的抗炎机制。指导临床上运用肝素治疗重症急性胰腺炎以及其他各种炎症相关疾病。研究方法：首先采用荧光光谱仪和圆二色谱仪研究终浓度分别为50、100和1000 U/L的肝素与HMGB1 (25 mg/L)结合后后者的特征荧光光谱、同步荧光光谱和二级结构组成成份的变化,空白对照组为不加肝素刺激组。然后用表面等离子体共振(SPR)技术,实时分析肝素与HMGB1 (50mg/L)、HMGB1与RAGE、肝素与RAGE的亲和常数,利用binding analysis分析浓度为50、100、1000和10000U/L的肝素对HMGB1/RAGE配受体结合的影响。随后,通过荧光共振能量转移技术(FRET)检测HUVEC表面肝素(0、0.1、0.5、1.0、10和100 U/L)对HMGB1 (0.1 mg/L)/RAGE以及HMGB1/TLR4的能量转移效率的影响。最后,通过免疫印迹法考察肝素对HMGB1放大LPS致炎作用的影响。分别检测HUVEC经HMGB1 (0.1mg/L)、LPS (0.75ng/mL)以及不同浓度肝素(0、0.01、0.1、1.0、10、50和100U/L)共同刺激后总蛋白水平p-p38 MAPK和ERK1/2 (p-p44/42) MAPK的表达以及核蛋白水平NF-κB的表达变化；用酶联免疫吸附试验检测刺激因素同上的HUVEC分泌细胞因子TNF-a和IL-6的情况。实验结果：普通荧光光谱显示,加入肝素后,HMGB1的荧光峰值呈先升高再下降的特征；同步荧光光谱显示HMGB1的发射波长发生红移；圆二色谱显示,HMGB1在加入肝素以后,各种二级结构的组成成份发生了明显的变化,β折叠的含量减少,α螺旋的含量增加。当HMGB1为25 mg/L时,加入50 U/L的肝素对其特征荧光峰峰值、同步荧光发射波长和二级结构组分的影响最为明显。SPR实验结果,肝素与HMGB1的结合速率常数ka=1.78×105L/mol·s,解离速率常数kd=8.02×10-4s-1,亲和常数KA=2.22×108L/mol,解离平衡常数KD=4.5×109mol/L; HMGB1与RAGE的结合速率常数ka=1.85×103L/mol-s,解离速率常数kd=1.81×10-4s-1,亲和常数KA=1.02×107L/mol,解离平衡常数KD=9.77×10-8mol/L。肝素与RAGE的亲和力极低。当浓度分别为50、100、1000、10000 U/L的肝素与HMGB1混合后,后者与RAGE的亲和力下降,由100RU降为50RU左右,下降绝对值依次为48、50、62、55RU。上述不同浓度的肝素组之间对HMGB1/RAGE亲和力下降影响的差异没有统计学意义(P>0.05)。FRET结果显示在HUVEC细胞表面,100 U/L肝素对HMGB.1/RAGE、10 U/L肝素组对HMGB1/TLR4的能量转移效率造成的下降最明显(P<0.05),均可使相应的能量转移效率较对照组下降约50%。但是不同浓度肝素组之间造成的差异没有统计学意义(P>0.05)。最后,免疫印迹结果证实,50 U/L肝素对HUVEC核蛋白水平的NF-κB以及总蛋白水平的p-p38MAPK、ERK1/2(p-p44/42) MAPK的表达所致的下降最明显,差异具有统计学意义(P<0.05)；50 U/L的肝素对HUVEC分泌促炎因子TNF-a和IL-6的抑制作用最明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验结论：实验表明肝素能够与HMGB1发生结合,并改变HMGB1的构象,从而影响HMGB1与其高亲和力配体RAGE的亲和力,阻断HMGB1/RAGE, HMGB1/TLR4的结合,进而影响HMGB1/RAGE介导的NF-κB,p-p38MAPK、ERK1/2(p-p44/42) MAPK信号传导通路的激活,抑制炎症因子TNF-α、IL-6的释放,而达到阻断HMGB1放大LPS致炎作用的目的。上述作用并不与肝素的浓度呈明显正相关。提示我们,用较小浓度的肝素即可达到比较理想的抗炎效果,又能大幅降低大剂量使用肝素导致的出血的风险。这对指导临床上运用肝素治疗脓毒症、重症急性胰腺炎以及各种其他炎症相关疾病都具有重要的指导意义。