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目的:采用动物血清药理学方法,游离脂肪酸诱导建立非酒精性脂肪肝体外模型,观察加味茵芍散含药血清对非酒精性脂肪肝细胞模型中脂质代谢、肝酶指标的作用及自噬中Ⅲ型PI3K/Beclin1通路的影响,进一步探讨该方治疗非酒精性脂肪肝的作用机制。方法:将HepG2细胞用不同终浓度的油酸和棕榈酸(摩尔比为2比1)混合液诱导培养24h,CCK-8法、油红O染色确定建立NAFLD细胞模型的最佳诱导浓度;光电比色法鉴定NAFLD细胞模型;CCK-8实验筛选出各组含药血清最佳作用浓度;通过游离脂肪酸诱导建立NAFLD细胞模型后,实验分为空白对照组、模型组、中药组和易善复组,光电比色法检测各组细胞内TG、AST、ALT含量;Real-time PCR检测自噬相关指标Beclin1和LC3-II mRNA表达水平,Western blot测定Beclin1和LC3-II的蛋白表达。结果:1.CCK-8检测显示:HepG2细胞用不同终浓度的油酸和棕榈酸(摩尔比为2比1)混合液诱导培养24h后,当油酸和棕榈酸混合液终浓度超过0.5mmol/L时对HepG2细胞活力具有显著的抑制作用。2.油红O染色观察结果:与空白对照组相比,模型组细胞内有明显的脂滴形成;同时光电比色法结果显示,与空白对照组相比,模型组细胞内TG含量明显升高(P<0.05)与空白对照组相比,模型组细胞上清液中AST、ALT含量明显升高(P<0.05)。3.以胎牛空白血清组作对照,HepG2细胞经不同浓度(5%、10%、20%)的大鼠空白血清、加味茵芍散含药血清及易善复含药血清培养24h后,CCK-8检测显示,细胞经过浓度为5%各组含药血清培养后,对细胞活力影响最小。4.光电比色法结果:与空白对照组相比,模型组细胞内TG含量及细胞上清液中AST、ALT含量明显升高(P<0.05);各药物组细胞内TG含量及细胞上清液中AST、ALT含量均高于模型组(P<0.05)。5.实时荧光定量PCR结果:经0.5mmol/L的油酸和棕榈酸混合液诱导HepG2细胞24h后采用5%含药血清培养3h时:各组间LC3-II和Beclin1 mRNA表达水平无显著差异;培养6h时:与空白对照组比较,模型组HepG2细胞内LC3-II和Beclin1 mRNA表达降低(P<0.05),与模型组比较,中药组和易善复组LC3-II和Beclin1 mRNA表达无显著差异;培养12h时:与空白对照组相比,模型组HepG2细胞内Beclin1和LC3-II mRNA表达水平显著降低(P<0.05),与模型组比较,中药组、易善复组Beclin1和LC3-II mRNA表达水平显著升高(P<0.05);在12h时,中药组上调Beclin1和LC3-II mRNA表达效果最佳。培养24h:各组间Beclin1和LC3-II mRNA表达水平无显著差异。6.WesternBlot法结果显示:经0.5mmol/L的油酸和棕榈酸混合液诱导HepG2细胞24h后采用5%含药血清培养3h时:各组间LC3-II和Beclin1蛋白表达无显著差异;培养6h时:与空白对照组比较,模型组HepG2细胞内LC3-II和Beclin1蛋白表达降低(P<0.05),与模型组比较,中药组和易善复组LC3-II和Beclin1蛋白表达无显著差异;培养12h:与空白对照组相比,模型组HepG2细胞内Beclin1和LC3-II蛋白表达显著降低(P<0.05),与模型组比较,中药组、易善复组Beclin1和LC3-II蛋白表达显著升高(P<0.05);在12h时,中药组上调Beclin1和LC3-II表达效果最佳。培养24h:各组间Beclin1和LC3-II蛋白表达无显著差异。结论:1.加味茵芍散含药血清具有减轻FFA诱导的HepG2细胞内脂质过度堆积和肝损伤程度作用,从而改善肝细胞脂质代谢紊乱。2.加味茵芍散含药血清明显上调HepG2细胞内自噬相关基因Beclin1、LC3-II mRNA表达和Beclin1、LC3-II的蛋白表达。3.在FFA诱导HepG2细胞脂肪变性过程中,细胞内的自噬相关基因表达降低,加味茵芍散含药血清明显上调自噬相关基因Beclin1、LC3-II mRNA表达和Beclin1、LC3-II的蛋白表达,从而激活III型PI3K/Beclin1信号通路,加味茵芍散含药血清对NAFLD体外调控的机制可能与自噬水平升高有关。4.本实验是基于III型PI3K/Beclin1信号通路探讨加味茵芍散治疗NAFLD机制,就目前研究进展而言,NAFLD的发病机制较为复杂,其发生常伴有氧化应激及炎症反应,加味茵芍散能否通过自噬作用减轻其氧化应激和炎症反应从而发挥保护肝脏的作用,值得进一步的实验研究。