纤维化可导致器官结构破坏和功能减退、乃至衰竭,研究证实肺间质纤维化的发生、发展与TGF-β₁的高表达密切相关。TGF-β₁由淋巴细胞和单核细胞产生,有多种生物活性;能刺激未成熟肺成纤维细胞生长、增殖,刺激细胞分化或基质合成,增加ECM的聚积并抑制其降解;在肺纤维化形成过程中主要作用于胶原的转录和翻译过程,诱导前胶原mRNA的产生,促进胶原蛋白的形成和沉积。因此,TGF-β₁是促进肺纤维化的关键因子之一,抑制TGF-β₁基因表达显然有助于延缓肺纤维化进程,而应用常规抗纤维化药物抑制其表达的效果并不理想。RNAi技术具有高效、特异、安全地调节基因表达的特点,是人为导入正、反义RNA片段形成的双链RNA,在体内或体外培养的细胞内产生21et23核苷酸的siRNA,介导其互补同源mRNA序列特异性降解,从而抑制靶基因的转录后表达。其作用类似于基因敲除,但基因表达并未永远消除,因而又被称为“基因沉默”。本研究针对BALB/c小鼠TGF-β₁的mRNA序列设计并合成正义链经化学修饰的siRNA（即Stealth siRNA）,通过脂质体转染体外培养的小鼠LFb,观察并分析其对TGF-β₁及其下游CTGF因子表达的影响,为肺纤维化的防治提供实验依据。方法1.小鼠肺成纤维细胞的原代培养、鉴定及纯化传代采用组织块培养法分离培养小鼠肺成纤维细胞,HE染色光镜观察和波形蛋白免疫细胞化学法鉴定所得细胞,纯化传代至第3代细胞冻存备用。2.特异性Stealth siRNA的设计制备及转染细胞根据BALB/c小鼠TGF-β₁的mRNA序列应用invitrogen公司的在线设计软件BLOCK-iT^TM RNAi Designer,选择三个位点分别靶向设计得到三套Stealth siRNA序列,并照序列制备Stealth siRNAs。将第4代细胞分至24孔板培养至汇合度达30～50%待用。实验设空白对照组、空转染组、stealth_control组、stealth₄8组、stealth₁66组和stealth₅94组（4孔/组）,阴性对照组（stealth_control）主要用于检测转染效率。空白对照组不加刺激物,空转染组只加入脂质体而不加入Stealth siRNAs,其余各组通过脂质体转染三套不同序列（stealth₄8、stealth₁66、stealth₅94和stealth_control）的Stealth siRNA。3.特异性Stealth siRNA对TGF-β₁表达的干扰作用分别选择转染0h、24h、48h、72h和96h共五个时相点,收集各组细胞分为三个部分,用免疫细胞化学法、RT-PCR和Western blot法检测细胞中TGF-β₁及其下游的CTGF表达情况。观察特异性Stealth siRNA对TGF-β₁表达的干扰作用。结果1.小鼠肺成纤维细胞HE染色和波形蛋白免疫组化鉴定及台盼蓝染色测细胞活力:组织块法分离培养的细胞经HE染色后,光学显微镜下见细胞呈长梭形或多边形,平行排列生长,胞浆红染,胞核蓝染,其内可见2～3个蓝色深染的核仁。细胞波形蛋白免疫组化染色阳性,胞浆呈棕色。台盼蓝染色检测培养的LFb细胞活力在96%左右。2.特异性Stealth siRNA的设计合成及转染效率在GenBank网站上查得BALB/c小鼠TGF-β₁ mRNA序列,用在线软件BLOCK-iT^TMRNAi Designer选择三个位点,靶向设计得到三套Stealth siRNA序列,同时设计一套序列相同但不针对TGF-β₁的stealth_control,并用FITC标记,序列见表2-1,交由invitrogen公司合成。转染后在不同的时相点观察荧光表达情况,转染效率均达98%以上。3.小鼠肺成纤维细胞中TGF-β₁及其下游的CTGF因子的表达情况各组均可观察到TGF-β₁及其下游的CTGF因子阳性表达,三组转染Stealth siRNAs的细胞中阳性表达明显弱于对照组,其中stealth₁66组阳性表达最弱;而同组间在不同的时相点,其阳性表达也不同,转染24h后并不能检测到表达减低,48h后开始检测出表达减低,72h后表达减低最为明显,但转染96h后表达减低弱于前一时相点。结论实验结果表明在合成的特异性Stealth siRNAs作用下,体外培养的BALB/c小鼠肺成纤维细胞增殖速度减慢,细胞中TGF-β₁及其下游的CTGF因子的表达也明显低于对照组,说明特异性Stealth siRNA可有效抑制目的基因TGF-β₁的表达;同时这种抑制效应存在一定的时-效关系,即:转染48h后能检测出抑制效应,72h左右达到最高峰,96h后抑制效应开始减弱。