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帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一种中老年人易得的以脑内纹状体多巴胺含量削减和黑质区多巴胺能神经元的缺失为特质的神经退行性疾病。有调查表明,帕金森症状表现为纹状体多巴胺水平下降约80%且黑质中多巴胺神经元丢失约50%。PD在临床上的表现主要为静止性震颤、运动缓慢、肌肉强直和姿势反射受损,使患者的生活和就业产生严重影响。我国65岁以上人群中患有PD的越来越多,得病率已达到与发达国家相似的概率。目前,关于PD病因尚未清楚,其受很多因素的影响,世界各国研究神经疾病的人员也越来越关注PD。近年来,铁死亡(Ferroptosis)这种死亡模式备受关注,其与肿瘤、神经系统疾病、肾损伤、缺血再灌注损伤等疾病有关。有研究报道Ferroptosis可能与PD、阿尔兹海默症(Alzheimer disease,AD)等产生密切相关。为探讨Ferroptosis在PD中的作用,本实验采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶酶(1-methyl-4-pheny1-pyridinium,MPP~+)作用于PC12细胞构建帕金森病细胞模型,探究MPP~+诱导PC12细胞是否发生Ferroptosis和Ferroptosis发生的分子机制,以及在这过程中,Ferroptosis的发生对DJ-1表达的影响,能够为PD的分子机制研究提供一些理论基础。目的:探讨MPP~+诱导PC12细胞Ferroptosis的发生及其分子机制。方法:采用MTT法和台盼蓝染色法检测Ferrostatin-1预孵育PC12细胞2h后,1m M MPP~+处理PC12细胞,在6h、12h、24h、48h四个时间点细胞增殖的影响;LDH漏出率利用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒进行检测;采用酶标仪检测不同抑制剂预处理后MPP~+对PC12细胞损伤的作用、MPP~+作用PC12细胞后caspase-3的活性和细胞内谷胱甘肽(Glutataione,GSH)含量;采用流式细胞仪检测丹磺酰尸胺(Mondansylcadverin,MDC)染色的荧光强度、H2DCF-DA染色后胞质活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的水平和C11-BODIPY荧光探针标记的脂质ROS的水平;采用酶标仪分别检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量;利用透射电子显微镜观察细胞线粒体形态的变化;Western blot检测Ferrostatin-1预处理PC12细胞后膜铁转运蛋白(Ferroportin 1,FP1)、前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)、DJ-1蛋白表达变化;逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)检测Ptgs2、DJ-1基因表达变化。结果:1.Ferrostatin-1对MPP~+损伤PC12细胞的保护作用+(1)MTT法和台盼蓝染色法结果表明,MPP~+能明显抑制PC12细胞的增殖作用,且呈一定的时量效关系(P<0.01);Ferrostatin-1预处理2h后,能够降低MPP~+对细胞的损伤作用(P<0.01)。(2)与正常对照组相比,模型组LDH漏出显著增加(P<0.01),与模型组相比,Ferrostatin-1给药组LDH漏出显著降低(P<0.01)。2.MPP~+诱导PC12细胞损伤中Ferroptosis的存在(1)5种抑制剂中凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)、自噬抑制剂(3-Methyladenine,3-MA)、Ferroptosis抑制剂(Ferrostatin-1)和去铁胺(Defetoxamine,DFO)均能够在一定浓度范围内提高细胞的存活率(P<0.05),而坏死抑制剂(Necrostatin-1)没有此作用(P>0.05)。(2)MDC染色法检测细胞自噬,结果表明MPP~+损伤PC12细胞可以导致细胞自噬发生,Ferrostatin-1预处理后未发现细胞自噬率降低(P>0.05)。(3)酶标仪检测凋亡标记物caspase-3在胞内的表达量,结果表明,MPP~+作用PC12细胞后caspase-3的表达明显增加(P<0.01);Ferrostatin-1预处理后,caspase-3的表达并没有显著性的降低(P>0.05)。(4)采用H2DCF-DA荧光染色和C11-BODIPY荧光探针观察发现Ferrostatin-1能够抑制MPP~+诱导的细胞内胞质和脂质ROS的产生(P<0.05);检测发现Ferrostatin-1能够降低SOD活性(P<0.05)和升高MDA含量(P<0.05);Ferrostatin-1也能抑制MPP~+诱导PC12细胞内GSH含量降低(P<0.01);这些结果表明Ferrostatin-1抑制MPP~+诱导PC12细胞氧化应激导致的细胞死亡。(5)Western blot检测表明MPP~+诱导PC12细胞FP1表达量降低,而DFO剂量依赖性提高FP1的表达量(P<0.01)。(6)利用透射电子显微镜观察MPP~+诱导PC12细胞损伤,结果发现线粒体形态变小,线粒体膜密度增加;Ferrostatin-1保护后,线粒体形态接近正常,线粒体膜密度降低。3.MPP~+诱导PC12细胞Ferroptosis的分子机制(1)Western blot检测结果表明,MPP~+对PC12细胞作用后,Ferroptosis标志物Ptgs2的蛋白表达量明显增加(P<0.01),Ferrostatin-1保护后,Ptgs2蛋白的表达量显著降低(P<0.01)。(2)Western blot检测结果表明,MPP~+作用于PC12细胞后,GPX4蛋白表达量显著降低(P<0.01),Ferrostatin-1保护后,GPX4蛋白的表达量显著增加(P<0.05)。(3)Western blot检测结果表明,MPP~+作用于PC12细胞后,细胞内的DJ-1蛋白表达量明显降低(P<0.01),Ferrostatin-1预保护后,DJ-1蛋白在细胞中的含量有显著增加(P<0.05)。(4)RT-PCR实验结果表明,MPP~+作用于PC12细胞后,Ptgs2基因的表达量显著上调(P<0.01),而经Ferrostatin-1保护后,Ptgs2基因的表达显著下降(P<0.01)。(5)RT-PCR实验结果表明,MPP~+作用于PC12细胞后,DJ-1基因的表达量显著降低(P<0.01),而Ferrostatin-1处理后的细胞,DJ-1基因的表达量显著升高(P<0.01)。结论:研究结果表明MPP~+可以通过诱导细胞内氧化应激和增加铁含量引起Ferroptosis,且Ferroptosis抑制剂Ferrostatin-1能够阻止Ferroptosis的发生。MPP~+损伤PC12细胞发生Ferroptosis的分子机制可能与上调Ptgs2的表达和下调GPX4、FP1的表达有关;Ferroptosis的发生与DJ-1的表达也密切相关。