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目的研究雌激素、Sonic hedgehog (Shh)/Gli信号通路对乳腺癌干细胞(BCSCs)和细胞上皮间质转化(EMT)的作用及其生物学意义,探讨雌激素对乳腺癌细胞Shh/Gli通路影响、对乳腺癌干细胞干性及EMT的作用,通过特异性阻断Shh/Gli信号通路,观察对BCSCs和EMT的影响,探讨乳腺癌发病机制和新的靶向治疗方法。方法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测20种乳腺癌细胞系中雌激素受体(ER)、Shh信号通路转录因子Glil和BCSCs标记物ALDH1的表达并分析其相关性；Western blot和免疫荧光检测MCF-7、HCC1428、MDA-MB-231和BT549细胞系ER的表达；将4种乳腺癌细胞系分别分为酒精对照组、10nM雌二醇组和10nM雌二醇+1μM他莫昔芬组,Western blot和RT-PCR检测Gli1表达；MCF-7和HCC1428细胞系分别转染空质粒(shVEC)和Gli1干扰质粒(shGli1-1和shGli1-2),加入酒精或雌二醇培养,用流式细胞术、mammosphere形成和Western blot检测BCSCs干性的改变,划痕实验、Matrigel侵袭实验和Western blot检测对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响；用不同浓度雌二醇处理乳腺癌细胞系后,RT-PCR和Western blot检测Gli1、Shh和ALDH1的表达。免疫组化检测组织芯片ER、Gli1和ALDH1表达并分析相关性。结果1.20种乳腺癌细胞系中ER、Gli1和ALDH1mRNA均表达,但表达水平不同,线性分析显示ER的表达分别与Gli1和ALDH1呈正相关(r=0.845,p<0.01；r=0.385,p<0.05)。2.用雌二醇处理后,ER阳性细胞系(MCF-7、HCC1428) Gli1蛋白水平较对照组明显升高,联合他莫昔芬处理后,Gli1表达降低；在同样2个实验处理组中ER阴性细胞系(MDA-MB-231、BT549) Gli1表达无明显改变,说明雌激素只能在ER阳性乳腺癌细胞系中激活Shh/Gli1通路。3.MCF-7和HCC1428分别转染shVEC、shGli1-1和shGli1-2,经雌二醇处理后,Western blot和Realtime RT-PCI检测MCF-7和HCC1428细胞中BCSCs相关标记物ALDH1、Nanog、SOX2和Bmi-1蛋白和1nRNA水平的表达,shVEC细胞经雌二醇处理后ALDH1、Nanog、SOX2和Bmi-1蛋白和]mRNA表达水平明显升高,shGli1-1和shGli1-2雌二醇处理组与酒精对照组比较,ALDH1、Nanog. SOX2和Bmi-1蛋白和mRNA表达水平无明显变化,明显低于shVEC组(**或##P<0.01)。流式细胞术检测表达具有干细胞标记CD44+/CD24-/low亚型细胞的比例,shVEC细胞经雌二醇处理后表达CD44+/CD24-/low的细胞比例明显升高,shGli1-1和shGli1-2雌二醇处理组与酒精对照组比较,CD44+/CD24-/low细胞比例变化不大,都明显低于shVEC组(**或##P＜0.01)。相似的结果也在mammosphere形成实验得到验证,shVEC细胞的雌二醇处理组mammosphere的数量和体积都明显高于shVEC酒精对照组,shGli1-1和shGli1-2雌二醇处理组和酒精对照组mammosphere的数量和体积无明显变化,都明显低于shVEC组(**或##P<0.01)。4.随着雌二醇浓度的增加,Gli1和ALDH1的mRNA和蛋白表达水平逐渐升高,Shh的表达无明显变化,说明在ER阳性乳腺癌细胞中,雌激素通过Shh/Gli通路的配体非依赖的途径激活Gli1调控BCSCs (*P<0.05,**P<0.01)。5.MCF-7和HCC1428分别转染shVEC、 shGli1-1和shGli1-2, shVEC细胞经雌二醇处理后细胞发生EMT,其迁移和侵袭能力均增强；shGli1-1和shGli1-2雌二醇处理组细胞不发生EMT,与酒精对照组比较迁移和侵袭能力变化不大；与shVEC相比,shGli1-1和shGli1-2细胞的迁移和侵袭能力明显下降(**或##P<0.01)。6.组织芯片检测10例正常乳腺组织Gli1和ALDH1低表达,100例乳腺癌组织中Gli1和ALDH1的表达升高。线性分析乳腺癌组织ER与Gli1、ALDH1的关系,显示ER的表达分别与Glil和ALDH1呈正相关(r=0.713,p<0.01；r=0.476,p<0.01)。结论本实验初步证实：在ER阳性乳腺癌细胞中,雌激素通过激活Shh/Gli通路促进BCSCs的增殖和EMT。雌激素是通过不依赖配体的非经典途径激活Shh/Gli通路。Gli1可能成为乳腺癌治疗的潜在新靶点。