乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)是一种带有包膜的DNA病毒,有嗜肝性,可以造成人类持续性病毒感染。慢性HBV感染是世界范围内最为严重的公共卫生问题之一,是导致肝硬化和原发性肝细胞癌的主要原因。尽管目前已有预防性疫苗可有效预防新发HBV感染,但在全世界范围内仍有约2.48亿慢性HBV感染者,且难以被现有治疗手段治愈。现有基于干扰素类和核苷/核苷酸类似物及其组合的临床治疗策略虽能控制病毒复制,缓解疾病进展,但并不能有效实现临床治愈(通常<5%),停药后还存在复发的风险。大量研究表明作为HBV复制模板的cccDNA的持续存在是乙肝感染难以治愈的根本,而我们现有的药物并不能对cccDNA进行有效的清除,发展更为有效的治疗药物迫在眉睫。因此构建一个为高通量药物筛选服务的能快速检测或者指征HBV复制的体外细胞模型是很有必要的。本研究我们的目的就是试图构建一个用荧光来指示HBV复制的细胞模型,不需要任何额外的检测,只需通过荧光的变化来判断药物的作用。首先,为了尽可能小的对HBV本身产生影响,且考虑到HBV基因组表达框的高度重叠性,我们插入HBV基因组precore区的片段是仅有16个氨基酸的GFP11,但荧光和HBV的复制都受到了较大程度的削弱;接着我们对该系统的荧光进行了优化,有报道split mNG系统有更强的荧光信号,更低的背景荧光,即更高的信噪比,于是我们对split GFP和split mNG系统进行了比较,并将split mNG作为后续改进的基础;考虑到多质粒转染的低效性,我们构建了Dox诱导型的“all in one”的荧光报告系统,在初步验证该系统的可行性后,我们对该系统的荧光和HBV复制效率进行了探索优化;在荧光方面,通过对不同N1l变体和不同数量N11串联的比较,以及用于多顺反子表达的2A自剪切肽和22-nt Rbm3 IRSE的比较,发现DN11-E2A的组合方式相对较佳;在HBV复制效率方面,通过将A1901G型突变(CM型)配对换成A1852T/T1902A型突变(XM型)配对,发现在XM型情况下插入外源基因对HBV复制效率影响较小;另外,我们构建了稳定整合细胞株,在细胞株上对该系统进行了初步的荧光与HBV复制相关性的分析;最后我们对不同基因型的34个HBV(主要是B、C、D型)做了比较,找到了比我们现用的C型S11复制水平和感染能力高的HBV-D型的Dtw;并在Dtw骨架上对荧光报告系统中外源基因插入位点对HBV复制的影响做了初步的研究,发现插入位点在距HBV poly(A)序列中类“TATAAA”的模块右侧7bp处有相对较强的复制水平。综上,我们构建了一个能在一定程度上用荧光指示HBV复制的体外细胞模型——“all in one”荧光报告系统,但目前该系统的荧光强度和复制水平都较弱,关于对提高HBV复制效率方面进行探索的结果,还有待后续与该系统的整合应用和验证,而在荧光方面,该系统还有待进一步的优化。