【摘 要】
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背景:乳腺癌的治疗逐渐进入精准治疗时代,针对具体分子分型的各种靶向药物不断涌现。但目前对于部分转移性乳腺癌的治疗仍离不开化疗,三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）由于缺乏激素受体以及HER2表达,导致同样缺乏除化疗以外的有效治疗方法。LIM激酶1（LIMK1,LIM kinase 1）和p21激活的激酶4（PAK4,p21-activated kin
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背景:乳腺癌的治疗逐渐进入精准治疗时代,针对具体分子分型的各种靶向药物不断涌现。但目前对于部分转移性乳腺癌的治疗仍离不开化疗,三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）由于缺乏激素受体以及HER2表达,导致同样缺乏除化疗以外的有效治疗方法。LIM激酶1（LIMK1,LIM kinase 1）和p21激活的激酶4（PAK4,p21-activated kinase 4）在乳腺癌中过表达,导致侵袭性的表型和不良的临床预后。这两种激酶可调节细胞分裂,增殖和侵袭,还通过磷酸化雌激素受体α（ERα）促进MAPK途径的活化引起内分泌抵抗。PAK4可特异性磷酸化LIMK1及其功能伙伴,通过对PAK4和/或LIMK1的抑制,可能会影响乳腺癌的生长。泛素特异性蛋白酶47（USP47,Ubiquitin-specific protease 47）在许多癌症中过表达,它能够促进细胞发生上皮间质转化（EMT）,调节肿瘤细胞DNA修复和维持基因组稳定性,并且与预后不良相关。为此,本研究进行了LIMK1抑制剂LIMKi 3和PAK4抑制剂PF-3758309单药和联合对乳腺癌细胞株及异种移植模型中肿瘤生长影响的实验研究,并探究了抑制USP47在三阴性乳腺癌发生发展中的重要作用。方法:第一部分,本研究首先通过细胞活率检测对LIMKi 3及PF-3758309在不同分子分型乳腺癌细胞系中是否存在协同作用进行探究,再采用单药或两药联合对具有较好协同作用的Luminal型细胞系进行处理并检测细胞周期变化,通过Western blot检测药物影响激酶磷酸化、ERα磷酸化的情况及C-MYC表达变化。体内效应评价通过采用BT474细胞系构建异种移植瘤模型,应用单药或联合处理来证实药物在体内是否同样具有协同效应。影响LIMKi 3和PF-3758309药物敏感性的指标采用生物信息分析进行筛选,通过z GARP评分联合药物IC50来判断。第二部分首先采用USP47抑制剂P22077对三阴性乳腺癌细胞系进行处理,明确P22077是否能够具有体外抑制细胞增殖、迁移并诱导细胞周期阻滞及凋亡的能力。体内研究通过敲除USP47的小鼠细胞构建移植瘤,以及构建Py MT+/-/USP47-/-基因敲除小鼠的方式探究敲除USP47是否能够在体内抑制乳腺癌的发生发展。研究结果:第一部分结果显示两种药物联合对LIMK1和PAK4发挥协同抑制作用,能够抑制多种乳腺癌细胞系的生长,并诱导细胞周期阻滞及凋亡,体外应用两药联合能够更好的抑制ERα的磷酸化激活以及C-MYC表达,尤其在Luminal和HER2+的细胞中表现出较好的协同作用。体内实验显示,联合治疗在BT474异种移植模型中能够更好的抑制肿瘤发育和ERα驱动的信号转导。计算机分析表明,依赖LIMK1的细胞系最容易受到PAK4抑制剂的影响,对C-MYC的依赖性可能是影响药物敏感性的重要因素。第二部分结果显示,P22077在体外能够很好地抑制TNBC细胞增殖、迁移,抑制细胞内USP47蛋白及其底物YB-1的表达,且能够诱导细胞周期阻滞以及细胞凋亡。体外敲除USP47抑制了TNBC细胞系增殖及迁移。此外,在体内敲除USP47能够明显延长荷瘤小鼠生存期,影响肿瘤大小,这种效果可能是由于敲除USP47导致体内微环境的变化所引起。最后对公开数据库的分析显示,USP47在乳腺癌中通常表达升高,且预示着较差的预后。结论:LIMK1和PAK4双重抑制可能是一种新的潜在乳腺癌治疗策略,尤其在Luminal型和HER2+的肿瘤亚型中可能具有独特的功效。此外,靶向抑制USP47可能为TNBC患者的治疗带来一线希望。
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