卡尔文循环（Calvin-Benson-Bassham,CBB）是从无机碳生产有机生物质的主要途径,核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是CBB循环固定CO₂第一步反应中的关键酶和限速酶,Rubisco的羧化活性直接影响自养生物通过CBB循环进行CO₂固定的能力,在作物生产和全球碳循环中起着关键作用。Rubisco对CO₂的催化效率和选择性极低,而且其活性中心高度保守,利用现有的理性设计或定向进化手段对其进行改造收效甚微。因此,设计高效的高活性Rubisco筛选体系,探索未知的Rubisco,是目前的研究热点。此外,利用Rubisco的固碳活性合成生物基化学产品已成为微生物固碳研究的重要方向。目前已利用Rubisco在蓝藻、酿酒酵母中实现了产乙醇、异丁醛、L-丁醇和甘油等化学产品,但利用Rubisco在大肠杆菌Escherichia coli中固定CO₂产乳酸的研究尚未见报道。因此,本研究尝试在大肠杆菌体内建立一条Rubisco固定CO₂产乳酸的代谢途径。主要结果如下:1)在大肠杆菌中构建了一条甘油-木糖-Rubisco-PRK产乳酸代谢途径,其乳酸的理论得率为107.8%,¹³C标记的乳酸理论得率为25%。通过发酵条件优化和发酵菌株比较,最终确定发酵条件为:厌氧条件下,发酵培养基为M9,缓冲液为HEPES/Na HCO₃,诱导温度为22℃,发酵菌株为E.coli BW25113ΔfrdΔpfl B::ldh A。在此发酵条件下,该菌株的乳酸产量为2.51 g/L,乳酸得率为92.04%,¹³C标记的净乳酸得率为19.66%。2)通过细胞生长状态初筛和乳酸产量及¹³C标记的乳酸得率复筛,构建了适用于筛选高效Rubisco羧化活性的筛选体系。与已有筛选体系相比,该体系具有高通量、准确度高、更简便的优势。3)利用本课题构建的高效Rubisco羧化活性筛选体系,从23个带有不同来源Rubisco的E.coli中筛选到BW-RBC9菌株,其乳酸产量为3.1 g/L;乳酸得率为93.46%,接近理论得率107.8%;¹³C标记的净乳酸得率21.83%,接近理论得率25%。综上,本课题构建的甘油-木糖-Rubisco-PRK产乳酸代谢途径实现了Rubisco在大肠杆菌中固定CO₂产乳酸的功能;建立了一套适用于高通量筛选Rubisco的筛选体系,并成功筛选到高羧化活性的Rubisco,为今后利用Rubisco在大肠杆菌中固定CO₂产乳酸并实现产业化进行了有益的探索。