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目的:利用二硝基氯苯(DNCB)建立小鼠ACD模型,通过ACD小鼠皮损部位的组织形态改变、病理改变,评价基于益气祛风原则确立的针药并用方法对ACD的抑制作用,通过对ACD小鼠模型的相关细胞因子及其mRNA等水平的测定,从细胞、分子水平对其作用机制进行探求,以期为临床上更好的采用针药并用治疗ACD提供实验支撑。材料与方法:1实验材料SPF级昆明种白色雄性小鼠60只,4周龄,体重为(20±2)g。2实验方法2.1造模方法用小剂量DNCB溶液刺激法建立ACD小鼠模型2.2观察ACD小鼠耳部皮损变化情况通过观察针刺与益气祛风汤并用对ACD小鼠的左右耳的厚度差、重量差,来初步评价其对ACD的抑制作用。2.3观察ACD小鼠皮损组织形态学改变通过观察ACD小鼠皮损部位组织形态学病理变化,探讨针刺特定腧穴与益气祛风汤并用对ACD小鼠变态反应的影响。2.4 Elisa法检测小鼠血清中IL-6、IL-10、IL-17变化情况用Elisa法检测针刺与益气祛风汤并用后ACD小鼠的血清中IL-6、IL-10、IL-17的水平,阐释针刺与益气祛风汤并用对ACD小鼠血液中细胞因子的调节作用,进而说明ACD小鼠血液中Th17/Treg细胞间的平衡对ACD的影响。2.5 RT-PCR法检测小鼠病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA蛋白表达情况通过RT-PCR法检测针刺与益气祛风汤并用后ACD小鼠的病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA的表达,说明针刺与益气祛风汤并用对ACD小鼠病变组织中相关因子的mRNA含量,说明ACD小鼠病变组织中的Th17、Treg细胞的变化。2.6 Western Blot法验证小鼠病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA蛋白表达情况采用Western Blot法检测针刺与益气祛风汤并用后ACD小鼠的病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA的表达,从另一个角度说明针刺与益气祛风汤并用后ACD小鼠病变组织中相关因子的mRNA含量的变化,进一步说明Th17/Treg细胞平衡对ACD的影响。结果:1 ACD小鼠耳部皮损变化情况1.1各组耳厚度差的变化,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组耳厚度差明显高于空白组(P<0.05);针刺组、中药组、针药组、西药组与模型组相比较,耳厚度差均明显降低(P<0.05);与针刺组相比,中药组无差异(P>0.05),而针药组与西药组的耳厚度差低于针刺组(P<0.05);与中药组相比,针药组与西药组的耳厚度差更低(P<0.05),与针药组相比,西药组无明显差异(P>0.05)。1.2各组重量度差的变化,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组耳重量差明显高于空白组(P<0.05);针刺组、中药组、针药组、西药组与模型组相比较,耳重量差均明显降低(P<0.05);与针刺组相比,中药组无差异(P>0.05),而针药组与西药组的耳重量差低于针刺组(P<0.05);与中药组相比,针药组与西药组的耳重量差更低(P<0.05),与针药组相比,西药组无明显差异(P>0.05)。2 ACD小鼠皮损组织病理改变2.1空白组观察结果表皮厚度正常结构规整,细胞排列紧密,未见细胞内及细胞间水肿,偶见轻度炎细胞浸润。2.2模型组观察结果表皮增厚,过度角化,部分缺失,细胞内、细胞间水肿,细胞间距增大,内皮细胞肿胀,真皮乳头水肿,真皮内有大量的炎症细胞浸润,主要是以淋巴细胞为主的单一核细胞,少见多形核细胞,胶原纤维间隙增大血管扩张。2.3针刺组观察结果皮肤结构基本完整,表皮轻度角化不全,表皮略有增厚,细胞内、细胞间轻度水肿,真皮乳头水肿不明显,可见少数炎性细胞浸润,血管内皮细胞轻度肿胀,各层损伤程度较模型组明显减轻。2.4中药组观察结果表皮有轻度的角化不全,偶见水肿细胞,真皮乳头轻度水肿,有少数炎性细胞浸润,血管内皮细胞轻度肿胀,各层损害均较模型组明显减轻。(如图2-4)2.5针药组观察结果表皮厚度大致正常,偶有轻度角化,真皮内有少数炎性细胞浸润,血管内皮细胞轻度肿胀,各层损害明显轻于模型组。2.6西药组观察结果表皮厚度大致正常,偶见轻度角化不全,偶见水肿细胞,真皮内有偶有少量炎性细胞浸润,各层损害明显轻于模型组,与针药组皮肤结构相近。3 Elisa法检测小鼠血清中IL-6、IL-10、IL-17结果3.1用ELISA法检测各组小鼠的外周血中IL-6,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组外周血中IL-6表达明显高于空白组(P<0.01);针刺组、中药组、针药组、西药组与模型组相比较,外周血中IL-6表达均明显降低(P<0.01);与针刺组相比,中药组无差异(P>0.05),而针药组与西药组外周血中IL-6表达低于针刺组(P<0.05);与中药组相比,针药组与西药组外周血中IL-6表达明显降低(P<0.01),与针药组相比,西药组无明显差异(P>0.05)。3.2用ELISA法检测各组小鼠的外周血中IL-10,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组外周血中IL-10表达明显低于空白组(P<0.01);针刺组、中药组、针药组、西药组与模型组相比较,外周血中IL-10表达均明显升高(P<0.01);与针刺组相比,中药组无差异(P>0.05),而针药组与西药组外周血中IL-10表达低于针刺组(P<0.01);与中药组相比,针药组与西药组外周血中IL-10表达明显降低(P<0.01),与针药组相比,西药组无明显差异(P>0.05)。3.3用ELISA法检测各组小鼠的外周血中IL-17,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组外周血中IL-17表达明显高于空白组(P<0.01);针刺组、中药组、针药组、西药组与模型组相比较,外周血中IL-17表达均明显降低(P<0.01);与针刺组相比,中药组无差异(P>0.05),而针药组与西药组外周血中IL-17表达低于针刺组(P<0.01);与中药组相比,针药组与西药组外周血中IL-17表达明显降低(P<0.01),与针药组相比,西药组无明显差异(P>0.05)。4小鼠病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA蛋白表达4.1 RT-PCR法检测小鼠病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA蛋白表达情况4.1.1 ACD小鼠病变组织中IL-17mRNA蛋白表达,与空白组比较,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组小鼠病变组织中IL-17mRNA明显增加,差异明显(P<0.01);针刺组、中药组、针药组、西药组与模型组比较,IL-17mRNA表达明显下降,差异显著(P<0.01);与针刺组比较,中药组小鼠病变组织中IL-17mRNA表达差异不明显(P>0.05);与针刺组比较,针药组、西药组小鼠病变组织中IL-17mRNA明显下降,差异显著(P<0.01);与中药组比较,针药组、西药组小鼠病变组织中IL-17mRNA表达明显下降,差异明显(P<0.05);针药组与西药组比较IL-17mRNA表达差异不明显(P>0.05)。4.1.2 ACD小鼠病变组织中Foxp3mRNA蛋白表达,与空白组比较,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA明显下降,差异明显(P<0.01);针刺组、中药组、针药组、西药组与模型组比较,病变组织中Foxp3mRNA明显增加,差异显著(P<0.01);与针刺组比较,中药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA表达差异不明显(P>0.05);与针刺组比较,针药组、西药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA表达明显增加,差异明显(P<0.01);与中药组比较,针刺组小鼠病变组织中Foxp3mRNA表达明显增加,差异明显(P<0.05),西药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA表达明显增加,差异明显(P<0.01);与针药组比较,西药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA表达差异不明显(P>0.05)。4.2 Western Blot法检测小鼠病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA蛋白表达情况4.2.1 ACD小鼠病变组织中IL-17mRNA蛋白表达,与空白组比较,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组小鼠病变组织中IL-17mRNA明显增加,差异明显(P<0.01);与模型组比较,针刺组、针药组、西药组小鼠病变组织中IL-17mRNA表达明显下降,差异显著(P<0.01),中药组小鼠病变组织中IL-17mRNA表达明显下降,差异显著(P<0.05);与针刺组比较,中药组小鼠病变组织中IL-17mRNA表达差异不明显(P>0.05);与针刺组比较,针药组、西药组小鼠病变组织中IL-17mRNA明显下降,差异显著(P<0.05);与中药组比较,针药组、西药组小鼠病变组织中IL-17mRNA表达明显下降,差异明显(P<0.01);针药组与西药组比较IL-17mRNA表达差异不明显(P>0.05)。4.2.2 ACD小鼠病变组织中Foxp3mRNA蛋白表达,与空白组比较,模型组、针刺组、中药组、针药组、西药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA明显下降,差异明显(P<0.01);针刺组、中药组与模型组比较,差异不明显(P>0.05);针药组、西药组与模型组比较,病变组织中Foxp3mRNA明显增加,差异显著(P<0.01);与针刺组比较,针药组、西药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA表达明显增加,差异明显(P<0.01);与中药组比较,针刺组、西药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA表达明显增加,差异明显(P<0.01);与针药组比较,西药组小鼠病变组织中Foxp3mRNA表达差异不明显(P>0.05)。结论:1 ACD小鼠耳部皮损变化1.1针刺、益气祛风汤都能够减轻ACD模型小鼠耳部厚度差、重量差,两者结合应用效果更优。1.2验证了氯雷他定悬浊液可以降低ACD模型小鼠耳部厚度差、重量差,针刺与益气祛风汤并用与氯雷他定悬浊液对ACD模型小鼠耳部厚度差、重量差修复作用几乎等效。2 ACD小鼠皮损组织病理影响2.1针刺、益气祛风汤、针刺与益气祛风汤并用均能够减轻ACD小鼠病变组织的病理改变,但针刺与益气祛风汤并用组的效果更加明显。2.2验证了氯雷他定悬浊液可以减轻ACD模型小鼠病变组织的病理变化,针刺与益气祛风汤并用与氯雷他定悬浊液对ACD模型小鼠病变组织的病理变化的改善作用相近,确切机制有待进一步研究。3 Elisa法检测小鼠血清中IL-6、IL-10、IL-17表达3.1针刺、中药均能降低外周血中IL-6、IL-17表达,升高IL-10表达,针药并用效果更为明显。3.2验证了氯雷他定悬浊液可以降低ACD模型小鼠外周血中IL-6、IL-17表达,升高IL-10表达,针刺与益气祛风汤并用与氯雷他定对降低ACD模型小鼠外周血中IL-6、IL-17表达,升高IL-10表达,作用效果相当。4小鼠病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA蛋白表达4.1 PT-PCR检测ACD小鼠病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA蛋白表达4.1.1针刺、益气祛风汤都能够降低ACD模型小鼠病变组织中IL-17mRNA表达,升高Foxp3mRNA表达,将两者结合应用效果更明显。4.1.2证实了氯雷他定悬浊液可以降低ACD模型小鼠病变组织中IL-17mRNA表达,升高Foxp3mRNA表达,针刺与益气祛风汤并用与氯雷他定的作用相近。4.2 Western Blot检测ACD小鼠病变组织中IL-17mRNA、Foxp3mRNA蛋白表达4.2.1针刺、益气祛风汤对ACD模型小鼠病变组织中IL-17mRNA和Foxp3mRNA表达作用不明显,但将两者合用能够降低ACD模型小鼠病变组织中IL-17mRNA表达,升高Foxp3mRNA表达,这一结果与PT-PCR检测结果不一致,其发生原因有待在以后的研究中进一步探索。4.2.2证实了氯雷他定悬浊液可以降低ACD模型小鼠病变组织中IL-17mRNA表达,升高Foxp3mRNA表达,针刺与益气祛风汤并用与氯雷他定的作用相近。