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木本植物的次生木质部发育是木材产生的生物学基础,起始于维管形成层细胞的分裂与分化。维管形成层细胞分化后发生扩张,再经过次生壁沉积、细胞程序性死亡等过程,最终形成成熟的次生木质部细胞。现有报道已证明木材形成受到由植物激素和转录因子组成的复杂网络调控。此外,充足的能量功能及稳定的能量代谢也是木材发育过程所必需的。然而,细胞能量状态信号如何影响树木次生发育的分子机制目前尚不清楚。线粒体是真核细胞进行有氧呼吸的主要场所,葡萄糖在线粒体中发生分解代谢并释放出能量。最近的研究表明,线粒体信号在植物发育和对环境刺激的响应中发挥重要作用。线粒体作为一种半自主性细胞器,拥有独立于核基因组的遗传物质,但其遗传物质的表达需要大量核基因编码并定位于线粒体的蛋白参与。这些蛋白主要参与线粒体编码基因的转录后调控过程。PPR（Pentatricopeptide Repeat）蛋白家族正是线粒体编码基因RNA代谢的关键调控因子之一。PPR蛋白广泛存在于真核生物中,通常包含2-27个PPR基序。近年来诸多研究表明,线粒体定位的PPR蛋白对线粒体编码基因的表达具有重要调控作用,参与包括内含子剪接、5’端和3’端UTR剪切、RNA编辑和翻译等过程在内的线粒体编码基因的转录后调控,从而影响拟南芥、玉米等草本植物的种子育性、对环境胁迫的响应甚至整个生长发育过程。但目前还鲜有研究揭示PPR蛋白在木本植物生长发育过程中所发挥的作用,尤其是其对次生发育过程是否具有调控功能仍需进一步研究。为了探究PPR蛋白在木本植物次生发育过程中的功能,我们前期通过生物信息学分析,在毛白杨中分析鉴定了一种P类PPR蛋白（命名为PtoRFL30）,并观察到PtoRFL30过表达转基因植株的形成层细胞和木质部细胞层数被显著抑制。这说明PtoRFL30参与了维管组织次生发育的调控。因此本论文以毛白杨为研究模型,旨在明确PtoRFL30对毛白杨茎次生维管组织发育的调控作用,并解析其调控机制。主要的实验结果如下:1.为了探究PPR蛋白是否会通过线粒体调控杨树茎次生发育,筛选到一个在杨树茎中高表达且被预测定位于线粒体的P类的PPR蛋白,根据其编码基因在染色体的位置将其命名为PtoRFL30。2.为了明确PtoRFL30的组织表达模式,通过荧光定量PCR检测了其在杨树各组织中的表达量。结果显示,PtoRFL30的表达水平在茎和幼叶中显著高于根、成熟叶和叶柄。GUS染色分析进一步证明,PtoRFL30在次生维管组织中特异性表达于维管形成层。因此,推测PtoRFL30可能参与调控杨树的次生发育。3.为了确定PtoRFL30在次生维管组织发育过程中的功能,构建了其过表达和RNA干扰载体,并获得转基因植株。表型观察发现,PtoRFL30过表达株系的形成层和木质部细胞层数相比野生型植株均显著减少,而PtoRFL30干扰株系则表现出相反表型。这些结果表明,PtoRFL30在杨树的次生发育中起到负调控作用。4.为了探究PtoRFL30对线粒体功能信号是否存在调控作用,利用半定量PCR和荧光定量PCR分析了PtoRFL30转基因植株中线粒体编码基因的表达。结果表明,PtoRFL30影响大多数线粒体编码基因的表达。进一步在转基因植株中定量检测线粒体功能指标H2O2和ATP含量发现,PtoRFL30过表达导致H2O2和ATP含量显著下降,这与活性氧特异性染料DAB和NBT染色结果一致,表明PtoRFL30的过表达干扰了线粒体的功能信号。5.为了确定PtoRFL30蛋白对杨树次生维管组织发育的调控是否依赖于线粒体功能信号,外源施加线粒体呼吸链抑制剂破坏野生型和PtoRFL30干扰株系的线粒体功能信号,分析杨树的次生发育表型。结果表明线粒体功能障碍植株表现出严重的维管形成层发育缺陷,说明线粒体功能正常发挥对于次生维管组织发育的正常进行至关重要。线粒体复合体抑制剂处理PtoRFL30干扰株系结果表明,抑制剂处理会一定程度恢复干扰株系的表型,处理后形成层和木质部层数相对减少。表明PtoRFL30蛋白调控次生发育过程依赖于线粒体功能信号。6.为了解析PtoRFL30介导线粒体调控次生发育的下游信号,利用比较转录组手段,分析了野生型与线粒体功能信号被破坏的转基因植株PtoRFL30过表达植株的差异表达基因,并利用荧光定量PCR对转录组数据进行了验证,其中影响生长素转运和活性的基因PIN1、PIN2、GH3.5等表达水平明显下调。因此,猜测生长素可能是PtoRFL30介导的线粒体调控次生发育过程所依赖的下游信号途径。7.为了确定生长素是否参与介导线粒体信号对次生维管发育的调控,利用LC-MS测定了PtoRFL30转基因植株和野生型植株中生长素的含量。结果表明,PtoRFL30的过表达导致杨树茎中生长素含量降低,表明其负调控生长素累积水平。使用生长素NAA和生长素极性运输抑制剂NPA外源处理PtoRFL30过表达及其RNA干扰植株,观察转基因植株的次生维管组织发育的恢复情况。结果显示,NAA处理后PtoRFL30过表达植株的形成层和木质部细胞层数均增加,而NPA处理后RNA干扰植株的形成层和木质部细胞层数则显著减少,均与野生型相近。在外源破坏线粒体功能信号的处理条件下,使用NAA外源处理,并观察次生维管发育的变化情况。结果表明,NAA能够在一定程度上恢复线粒体功能信号被破坏后引起的次生发育缺陷表型。这些结果表明,生长素信号参与PtoRFL30介导的线粒体功能稳态调控次生维管发育过程。综上所述,本论文的结果表明PtoRFL30通过影响线粒体功能稳态并级联下游的生长素,从而调控杨树次生维管发育的过程。这些结果为理解线粒体功能信号调控木材形成和植物发育提供了新思路。