布鲁氏菌病（Brucellosis,简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella,简称布菌）入侵机体后引起的传染-变态反应性人兽共患细菌病。布菌是一种典型的胞内寄生菌。布菌入侵机体后通过与宿主细胞内质网互作形成复制型菌泡（r BCV）得以在宿主细胞内复制增殖和生存。在布菌与宿主细胞内质网互作的过程中,能导致内质网的结构重组,产生内质网应激反应（ERS）及其引起的未折叠蛋白反应（UPR）。现有研究显示,布菌Ⅳ型分泌系统（T4SS）分泌的效应蛋白是引起宿主细胞产生ERS的原因之一。布菌效应蛋白分为:T4SS依赖型和T4SS非依赖型两种,但是对于T4SS非依赖型效应蛋白是否也能导致宿主细胞产生ERS目前还不了解。本研究旨在探讨T4SS非依赖型效应蛋白在诱发细胞ERS中的作用。布菌BspI蛋白为T4SS非依赖型效应蛋白,是由布菌的一号染色体基因BAB1-1865编码,含有3个独特的结构域:信号肽域（1-17Aa）、转膜域（17-33Aa）及GTPase活化域（98-220 Aa）。其中GTPase活化域理论上能够调节内质网小G蛋白的活性,影响内质网的组装,这暗示着其可能参与布菌胞内感染引起宿主细胞的ERS。因此,本实验选取T4SS非依赖型效应蛋白BspI为研究对象,探讨T4SS非依赖型效应蛋白在诱发细胞ERS中的作用,并分析其可能的分子机制。首先利用菌落PCR扩增布菌BspI基因,将其置于原核表达载体构建p GEX4T-1-BspI表达质粒,以IPTG为诱导剂诱导BspI蛋白在大肠杆菌BL21中融合表达（GST-BspI）,并对GST-BspI融合蛋白进行纯化。将纯化后的GST-BspI融合蛋白与RAW264.7巨噬细胞裂解液进行富集沉降（Pull-down）实验,通过与对照组比较,选取SDS-PAGE上差异条带进行质谱分析,结果显示布菌BspI蛋白可以与UPR分子伴侣Bip蛋白发生互作。为了进一步探究布菌BspI蛋白是否可以引起巨噬细胞的UPR以及相关调节功能,本研究再次构建原核表达载体p ET-28a-BspI,明确可溶性重组BspI蛋白表达量达到最高的最佳条件。利用AKTA蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化,经透析后最终收获均一的可溶性目的蛋白BspI。利用CCK-8实验确定BspI蛋白对RAW264.7细胞增殖毒性的影响,选取合适的BspI蛋白刺激浓度。然后对BspI蛋白刺激后的RAW264.7细胞进行Western blot实验,结果显示Bip蛋白表达量相比于对照组有明显增加,说明布菌BspI蛋白可能引起RAW264.7细胞发生ERS。为进一步验证该结论,利用ELISA试剂盒检测相关细胞因子IL-6与TNF-α表达量变化,结果显示二者表达量均有所增加。最后通过qPCR、Western blot以及免疫荧光实验检测UPR相关通路的标志分子,结果显示在mRNA水平及蛋白水平XBP-1的表达量均有所增加,因此表明布菌BspI蛋白可以激活UPR中的IRE-1通路。综上所述,本研究发现了布菌T4SS非依赖型效应蛋白BspI能够与巨噬细胞Bip蛋白互作,并能诱导Bip蛋白表达增加,进而引起宿主细胞发生UPR,激活IRE-1通路。我们的结果表明布菌T4SS非依赖型效应蛋白可能与T4SS依赖型效应蛋白一样也能诱导ERS。该研究成果加深了我们对布菌引起的ERS的理解,同时也可能为将来进一步深入探究布菌感染引起的宿主细胞ERS机制奠定实验基础。