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背景和目的胰腺癌是致死性极强的恶性肿瘤,在世界范围内居肿瘤致死病因的第四位。胰腺癌在早期缺乏有效的诊断手段,中位生存期只有6到8个月,5年生存率<5%。胰腺癌发病原因发杂,涉及众多的基因表达及调控,是多基因异常累积的结果。为研究其发病机制,研究人员构建了KC(LSL-Kras G12D/+,Pdx-1-Cre)和KPC(LSL-Kras G12D/+,Trp53R172H/+,Pdx-1-Cre)基因工程小鼠来模拟胰腺癌的发病过程。P53作为抑癌基因,其突变体广泛参与肿瘤的发生发展过程。P63基因属于p53转录家族中的一员,其异常表达与肿瘤有很大的关系。由于启动子的不同,p63又可以被分为TAp63和?Np63两大类。?Np63α是p63在肿瘤中的主要表达亚型,在肿瘤发生中发挥重要的作用。?Np63α可结合p53的下游靶基因发挥显性失活作用阻碍p53的抑癌作用,被认为是致癌基因,也有报道称其可与p53突变体结合,发挥抑癌作用。在胃癌中,?Np63α抑制肿瘤细胞增殖,但在乳腺癌中促进肿瘤细胞增殖。在肺癌中?Np63α抑制细胞迁移,在乳腺癌中却促进细胞迁移。在乳腺癌、头颈部鳞癌和肺癌中,高表达的?Np63α肿瘤化疗药物敏感性增强;而在膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌中,高表达的?Np63α会降低化疗药的敏感性。针对以上问题,本研究用CRISPR/Cas9基因编辑技术将?Np63α基因定点敲入小鼠胰腺癌细胞DT6606,并对其在肿瘤细胞增殖、迁移、细胞干性和药物敏感性等方面的作用进行研究。方法1.px330-rosa26-sgRNA切割载体和同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α的构建。利用ZIFIT网站设计针对小鼠基因Rosa26位点的sgRNA序列,合成后,连接到px330质粒构建px330-Rosa26-sgRNA载体质粒。通过PCR获得目的基因片段,先连接到pc DNA3.1质粒上,获取CMV启动子和zeocin抗性标记之后,将片段连接到p Rosa26-1同源臂载体上,构建成同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α。2.细胞转染实验及阳性细胞的筛选。利用lipo2000脂质体转染试剂,将同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α和px330-Rosa26-sgRNA载体共转染小鼠胰腺癌细胞DT6606,通过抗性标记博来霉素(Zeocin)筛选,初步获取具有抗性的转染细胞,用PCR鉴定?Np63α是否敲入。用q PCR检测Rosa26基因片段的含量来对?Np63α插入位置定位。3.?Np63α的表达及其对胰腺癌细胞增殖、迁移、细胞干性和化疗药物敏感性的观察。通过q PCR和免疫细胞化学,分别从RNA和蛋白水平检测?Np63α的表达情况;通过长时间动态活细胞成像系统,检测细胞群体增殖情况;通过克隆形成实验,检测单个细胞的增殖能力;用划痕实验检测细胞的迁移能力;通过干细胞球体形成实验来检测细胞的干性,用MTS实验来检测细胞对化疗药物的敏感性。结果1.成功构建了CRISPR/Cas9系统切割载体px330-rosa26-sgRNA和同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α。2.通过有限稀释法筛选单克隆细胞,成功的构建了在Rosa26位点定点敲入?Np63α基因的小鼠胰腺癌细胞亚系1B9和2D5,其中1B9比2D5具有更高的?Np63α的表达量。3.相较于DT6606细胞,1B9细胞形态发生了变化,细胞可呈卵圆形且成团生长,细胞间的界限不清,2D5细胞无明显变化。4.相较于DT6606细胞,2D5细胞有更强的增殖能力和迁移能力,1B9细胞的增殖能力明显降低,迁移能力无变化。肿瘤干细胞成球实验中,1B9和2D5的球体量都增多,但1B9细胞有更多的球体数量(p<0.001)。5.相对于DT6606细胞,1B9和2D5对胰腺癌化疗药吉西他滨的敏感性增高;其中1B9的敏感性低于2D5(p<0.001)。结论1.成功的构建了在Rosa26位点定点插入并高表达?Np63α的小鼠胰腺癌细胞DT6606的细胞亚系1B9和2D5。2.小鼠胰腺癌细胞在亚系形成、增殖、迁移、细胞干性和化疗药物敏感性等方面存在异质性。3.在Rosa26位点定点敲入?Np63α可促进小鼠胰腺癌细胞的干性并提高其对化疗药物吉西他滨的敏感性。