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钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）属丝／苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员，在肌肉中，calcineurin是受Ca2+信号活化的一种多功能信号酶，不仅其本身可介导多条信号转导途径，而且通过去磷酸化作用可对其他信号转导途径进行调节，将Ca2+信号与其他第二信使的调节机制偶联起来，调节肌肉中各种基因的表达，对肌肉发育有重要作用。Calsarcin（Calcineurin-associated sarcomeric protein）家族是一个与钙调神经磷酸酶（calcineurin）结合的肌肉特异蛋白质新家族，现已发现的calsarcin家族成员有三个calsarcin-1，calsarcin-2和calsarcin-3。其中，calsarcin-1基因在心肌和骨骼肌慢肌纤维中特异表达，而calsarcin-2和calsarcin-3只在骨骼肌快肌纤维中特异表达。同时calsarcin还作为肌肉中Z-Disc的重要结构蛋白而存在，因此calsarcin基因可能在肌纤维的分化和发育过程中发挥了重要的重要，从而对猪肉品质产生一定的影响。本实验首先从猪的骨骼肌中克隆到了calsarcin三个基因，对它们在染色体上的基因定位情况，肌肉发育过程中的表达规律，基因序列中的SNP位点进行了一系列分析，为进一步研究该家族基因在猪的肌肉发育中的作用奠定基础，并为其将来运用于标记辅助育种提供依据。另外，calsarcin家族的三个基因分别在慢肌和快肌中特异表达，本实验还从小鼠的calsarcin基因的启动子作为研究模型，对造成这种差异表达的基因表达调控机制做了初步的研究，考虑到与calsarcin发生互作的calcineurin在肌纤维的决定和分化中起到了关键作用，对calssrcin基因表达调控的研究也将为进一步阐明快慢肌纤维的决定和分化的分子机理提供依据。主要研究结果如下：1)从猪胚胎骨骼肌文库中分离得到了猪calsarcin-1基因，利用生物信息学和比较基因组学的方法克隆得到了猪的calsarcin-2和calsarcin-3基因，对三个基因的mRNA序列以及蛋白预测序列进行了初步分析。2)利用辐射杂种板技术分别将猪的calsarcin-1，calsarcin-2和calsarcin-3基因分别定位于猪的第8号，14号和2号染色体上。3)利用定量PCR技术检测了calsarcin-1和calssrcin-2在不同组织以及不同发育时期的肌肉中的表达情况。结果发现calssrcin-1和calsarcin-2基因的组织表达规律类似，主要在肌肉中表达。而两个基因的在肌肉发育过程中的表达规律有显著差异，calsarcin-1基因在胚胎期的表达呈下降趋势，而calsarcin-2基因的表达在同时期呈上升趋势，两者在出生后的表达都呈下降趋势。4)构建了猪calsarcin-1和calsarcin-2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体，转染PK15细胞，利用共聚焦显微镜对这两个蛋白在细胞内的位置进行了定位，结果发现两个融合蛋白主要都位于细胞核内。5)在中外猪群中利用PCR-RFLP的方法分别对猪calsarcin-1和calsarcin-2基因的各一个SNP位点进行了判型，结果发现中外猪种在这两个SNP位点的基因频率上表现出较大差异。6)利用定量PCR检测了小鼠calsarcin-1和calsarcin-2基因在C2C12细胞分化过程中的表达情况，结果发现两个基因在细胞分化过程中都呈上调表达。7)利用GenBank中的小鼠基因组信息，用长片段PCR克隆得到了小鼠calsarcin-1和calsarcin-2基因的启动子序列，并将其连接到pGL3-basic报告基因载体中，转染C2C12细胞发现报告基因的活性显著升高，证明了这两个启动子的有效性。利用启动子分析软件TESS对小鼠calsarcin-1和calsarcin-2基因启动子中的可能的调控元件进行了预测，然后构建了各种缺失突变的报告基因载体进行转染，发现calsarcin-1启动子中的一个可能的NFkB结合位点对该启动子活性影响很大，而calsarcin-2启动子中的预测的NFkB结合位点对该启动子活性影响不大。8)凝胶阻滞电泳实验证实了calsarcin-1启动子中的NFkB结合位点和NFkB转录因子的结合，而预测的calsarcin-2启动子中的NFkB结合位点并没有转录因子的结合。9)利用NFkB转录因子的抑制药物PDTC对该转录因子进行了抑制实验，结果发现PDTC能显著抑制calsarcin-1启动子的活性，而对calsarcin-2启动子影响不大。10)利用NFkB，NFAT和MEF2转录因子的表达载体和两个启动子共转染，结果发现NFkB只对calsarcin-1启动子有刺激作用，而对calsarcin-2启动子作用不大，而NFAT和MEF2转录因子对这两个启动子的活性都有一定影响，说明calsgrcin基因的表达受到各种信号通路的调控。