很多研究表明，血液中胆固醇或低密度脂蛋白的增高，将增加动脉粥样硬化疾病的发生率，而冠心病的死亡率与血胆固醇水平成正比关系。进一步的研究显示，服用降胆固醇药物而使血胆固醇降低后，患者动脉粥样硬化的并发症减少，生命延长。目前中草药已被广泛地应用于临床治疗高胆固醇血症，中药有效成分部位的研究是目前中药研究的主要方向。在我们研究所以往的研究中发现，四逆汤具有减轻家兔动脉粥样硬化，降低血脂的作用，而附子是四逆汤的主药。本实验室成功地从附子中提取了水溶性好、无毒的葡聚糖成分——附子多糖，并证实了其具有免疫调节和降血糖的作用。本实验则探讨其在高胆固醇饮食大鼠中的降胆固醇作用及其机制。　　 ㈠附子多糖降大鼠血胆固醇作用的实验研究。　　 ⑴附子多糖对大鼠血脂的影响。雄性，Wister大鼠50只，体重100±10g，随机分为正常组、高胆固醇组和附子多糖不同剂量组(224 mg/kg，448 mg/kg，896 mg/kg)，每组10只，分别给予正常饮食，高胆固醇饮食以及高胆固醇饮食加不同剂量的附子多糖，持续两周，眼球取血测定血清胆固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白。结果发现，饲喂高胆固醇饮食能显著增加血清胆固醇和低密度脂蛋白(+119％，+156％)(p＜0.05)，各剂量组(224 mg/kg，448 mg/kg，896 mg/kg)附子多糖能显著抑制喂高胆固醇饮食大鼠血清总胆固醇(-29％，-34％，-33％)和低密度脂蛋白的升高(-29％，-36％，-36％)(p＜0.05)。各剂量组均未见对血清甘油三酯和高密度脂蛋白有影响(p＞0.05)。提示：本课题中高胆固醇饮食饲喂两周后，可成功制成大鼠高胆固醇血症模型；附子多糖可明显降低喂高胆固醇饮食大鼠的血清胆固醇和低密度脂蛋白。　　 ⑵附子多糖对大鼠摄食量及粪便排出量的影响。雄性，Wister大鼠30只，体重100±10g，随机分成正常组(N组)、高胆固醇组(H组)和附子多糖组(F组：224 mg/kg)，每组10只，代谢笼单笼单养，饲喂两周，实验期每天计算(早八点至次日早八点)大鼠的进食量；收集大鼠粪便，称重。实验结果表明各组之间的摄食量及粪便排出量差异没统计学意义。提示附子多糖不通过改变动物的摄食量、粪便排泄量来影响血胆固醇水平　　 ⑶附子多糖对大鼠体重的影响。大鼠随机分成正常组、高胆固醇组和附子多糖(224 mg/kg)组，代谢笼单笼单养，饲喂两周。每三天称一次体重，直至第十五天，结果显示各组大鼠的体重都在增长，在相同的时间点，每组之间的体重增长差异没统计学意义。　　 ⑷肝组织切片常规HE染色观察附子多糖的作用。正常组、高胆固醇组和附子多糖(224 mg/kg)组大鼠，在第16天处死后各组取肝组织切片，常规HE染色观察；高胆固醇组大鼠的肝脏细胞脂肪变性较为明显，而附子多糖组肝脏细胞脂肪变性较轻微。　　 上述研究结果表明：①本课题中高胆固醇饮食饲喂两周后，可成功制成大鼠高胆固醇血症模型。②附子多糖可明显降低喂高胆固醇饮食大鼠的血清胆固醇和低密度脂蛋白；两周内附子多糖对高密度脂蛋白无影响，当血甘油三酯水平正常时，附子多糖对其亦无影响。③摄食量，粪便量和体重等研究提示附子多糖不通过改变动物的摄食量、粪便排泄量来影响血胆固醇水平。　　 ㈡附子多糖降血胆固醇作用的机制研究。　　 ⑴免疫组织化学检测肝组织LDL-R蛋白表达。肝组织免疫组织化学检测结果显示：高胆固醇组的低密度脂蛋白受体(LDL-R)的蛋白表达明显低于正常组(-x±s：H组2.60±0.67，N组4.60±1.58；p＜0.05)，而附子多糖组(224 mg/kg)肝组织LDL-R蛋白的表达明显高于高胆固醇组(F组7.53±2.04，H组2.60±0.67；p＜0.01)。　　 ⑵Western blotting检测肝脏中的LDL-R的表达及定量研究Western blotting检测显示高胆固醇组肝脏中的LDL-R蛋白表达较正常组明显减少(H组0.74±0.062，N组0.84±0.038；p＜0.05)，而附子多糖组肝组织LDL-R蛋白的表达较高胆固醇组(F组0.92±0.053，H组0.74±0.062;p＜0.05)及正常组(F组0.92±0.053，N组0.84±0.038；p＜0.05)均明显增加。　　 ⑶受体放射配基结合分析法测定肝脏LDL-R的密度和亲和力。受体分析检测显示：高胆固醇组肝脏中的LDL-R密度和亲和力较正常组均明显下降(H组8.14±1.28，N组13.34±1.92；p＜0.01)，(H组0.411±0.069，N组0.271±0.049;p＜0.01)；而附子多糖组的密度和亲和力较高胆固醇组明显升高(F组13.26±1.64,H组8.14±1.28；p＜0.01)，(F组0.249±0.037，H组0.411±0.069;p＜0.01);提示附子多糖使LDL-R数量增多，活性增强。　　 ⑷Realtime-PCR测定肝脏中HMG-CoA reductase的mRNA表达及定量研究。Realtime-PCR测定HMG-CoA reductase的mRNA结果显示：高胆固醇组较正常组明显增加(H组4.17±1.83，N组1.29±0.36;p＜0.01)；附子多糖组与正常组差异没有统计学意义，与高胆固醇组相比明显下降(F组0.73±0.39，H组4.17±1.83；p＜0.01)。提示附子多糖抑制了内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA reductase)的mRNA表达。　　 ⑸Realtime-PCR测定肝脏中CYP7α-1的mRNA表达及定量研究。Realtime-PCR测定肝脏中CYP7α-1的mRNA结果显示：高胆固醇组较正常组比较差异无统计学意义，而附子多糖组CYP7α-1的mRNA的表达较高胆固醇组(F组4.08±1.76，H组0.74±0.49；p＜0.05)及正常组(F组4.08±1.76，N组0.79±0.47；p＜0.05)均明显增加。提示附子多糖增加CYP7α-1的mRNA表达。　　 ⑹Western blotting检测肝脏中的CYP7α-1的表达及定量研究。肝脏中CYP7α-1的蛋白表达结果显示：高胆固醇组与正常组比较差异无统计学意义，而附子多糖组CYP7α-1的蛋白表达较高胆固醇组(F组2.92±0.095，H组0.74±0.062；p＜0.01)及正常组均明显增加(F组2.92±0.095，N组0.84±0.038;p＜0.01)。附子多糖促进CYP7α-1蛋白的表达。　　 ⑺粪便总胆汁酸的测定。雄性，Wister大鼠30只，体重100±10g，随机分为正常组，高胆固醇组和附子多糖组，代谢笼单笼单养，饲喂14天，收集大鼠最后72h粪便，用磷钼酸比色法测定粪便中的胆汁酸含量，结果发现：高胆固醇组大鼠的粪便中胆汁酸的含量明显增多(H组88.2±6.95，N组40.7±8.79；p＜0.05)，而附子多糖能进一步增加粪便中胆汁酸的含量(F组122.3±15.4，H组88.2±6.95；p＜0.05)。附子多糖能促进胆固醇向胆汁酸的转变，增加粪便中胆汁酸的排出。　　 上述研究结果表明：①附子多糖通过影响低密度脂蛋白受体蛋白表达，增加受体数量，增强受体活性来加强LDL的转运，清除，从而降低高胆固醇血症大鼠血清中的胆固醇和低密度脂蛋白。②附子多糖增加胆汁酸合成限速酶(CYP7α-1)的基因转录和蛋白表达，进而促进体内胆固醇加速转化为胆汁酸，并随粪便排出体外；从而降低高胆固醇血症大鼠血清中胆固醇和低密度脂蛋白。③附子多糖抑制了内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA reductase)的mRNA表达，可能通过改变该限速酶的活性，抑制内源性胆固醇合成，从而使血中胆固醇下降。　　 结论：　　 ⑴高胆固醇饮食饲喂两周后，可成功制成大鼠高胆固醇血症模型。　　 ⑵附子多糖从224～896 mg/kg，均可显著降低喂高胆固醇饮食大鼠的血清胆固醇及低密度脂蛋白；　　 ⑶附子多糖降低血清胆固醇效应的机制为：①增加肝脏中低密度脂蛋白受体蛋白的表达，增加受体数量及增强受体活性，从而提高体内LDL及胆固醇的转运、转化及清除；②增加胆汁酸合成限速酶的基因转录和蛋白表达，从而促进体内胆固醇转化为胆汁酸，随粪便排出体外;③附子多糖可能通过抑制内源性胆固醇合成限速酶，抑制内源性胆固醇合成。　　 本研究的创新点：　　 ⑴首次用喂高胆固醇饮食制成的高胆固醇血症大鼠模型研究得出附子多糖具有降血胆固醇和低密度脂蛋白的作用，国内外未见报道。　　 ⑵首次发现试验期内，当血甘油三酯水平正常时附子多糖对其无影响。　　 ⑶首次从低密度脂蛋白受体的基因水平、蛋白表达和受体活性等层面探讨附子多糖降血清胆固醇作用的机理。　　 ⑷从胆汁酸合成限速酶和内源性胆固醇合成限速酶等方面探讨附子多糖降血清胆固醇的机理，国内外暂未见报道。