第二信使环腺苷酸(cyclic AMP,cAMP)是重要的胞内调节因子。其由三磷酸腺苷(ATP)通过腺苷酸环化酶(AC)催化生成,能被磷酸二酯酶(PDE)降解成5’-AMP。多种胞外刺激如:激素、生长因子、神经递质等,通过G蛋白偶联受体活化AC,使胞内cAMP浓度升高,进而调控细胞增殖、细胞凋亡等诸多细胞生命活动。cAMP下游的效应因子如PKA(protein kinase A)和cAMP反应元件结合蛋白(cAMP element-binding protein,CREB)等介导了其生物学功能的发挥。实验表明PKA及CREB在内分泌组织的肿瘤发生中起着重要作用。而且长期的研究揭示高水平的cAMP浓度能促进肿瘤的发生发展,其中一个很重要的原因是cAMP能促进肿瘤细胞存活。然而在非恶性细胞中cAMP发挥双向调节的作用,既能促进细胞死亡也能抑制细胞死亡,因细胞类型及胞外刺激剂的不同而不同。我们课题组的前期工作说明,cAMP对MAPK家族主要成员JNK、p38的抑制作用是其在非恶性细胞中双向调节细胞存活的关键机制。一个让人不解的问题是为什么在非恶性细胞中cAMP是双向调节作用,而在肿瘤细胞中则成为单向的促存活作用?其中的分子机制仍未见报道。为回答这一科学问题,我们开展了相关研究,希望能阐明cAMP促肿瘤细胞存活的机制,为寻找新的抗肿瘤靶点奠定基础。我们以TNF-α敏感的成纤维瘤细胞L929细胞为研究模型。首先观测了多种cAMP“激动剂”对TNF-α诱导的L929细胞死亡的影响,实验结果表明提高胞内cAMP浓度显著抑制TNF-α诱导的L929细胞坏死,证实了cAMP在肿瘤细胞中的促存活作用。而后发现JNK活性促进TNF-α诱导的L929细胞死亡,而p38活性则起拮抗作用。cAMP促L929细胞的存活机制与其显著抑制JNK的活性,而同时不抑制p38活性密切相关。进一步研究显示cAMP抑制p38通路的重要负调控机制——DLC的表达上调——在L929细胞中存在缺陷,而cAMP抑制JNK通路的重要负调控机制——cFLIPL和MKP1的表达上调——在L929细胞中却没有缺陷。因为p38抑制因子及外源过表达DLC分子均能逆转cAMP保护作用,所以是L929细胞中一个促凋亡机制的缺陷,导致了cAMP在肿瘤细胞的“净”存活效应。这为我们提出的科学问题,提供了一种可能分子机制的解释。同时在研究中我们发现cAMP对JNK通路的抑制在其抑制TNF-α诱导L929细胞死亡方面发挥了重要作用。其中一个重要原因是cAMP通过CREB介导的转录,上调cFLIPL分子抑制MKK7活化,从而抑制JNK活性。但是除了cFLIPL,是否还有其它蛋白参与了调控MKK7分子,还不清楚。因此我们又开展了一些探索性的工作——寻找MKK7分子相互作用蛋白,以期能找到新的负向调控MKK7-JNK通路的分子,进而为更好地理解cAMP抑制JNK通路的机制奠定基础。我们利用酵母双杂交技术,从人胎脑文库中筛选到三个未见报道的MKK7相互作用蛋白:ORF60、GNB2L1、UBA3。通过免疫共沉淀的方法确定三个蛋白均能与MKK7相互作用,免疫印迹实验表明GNB2L1能增强本底JNK磷酸化的作用,ORF60与UBA3有部分抑制JNK活性的作用。荧光素酶分析结果显示GNB2L1能增强JNK下游转录因子AP-1的转录活性,而ORF60与UBA3则不同程度的抑制AP-1的活性,与免疫印迹结果相一致。提示克隆可能与MKK7相互作用后而影响JNK通路的活性。因而,我们筛选到了新的MKK7相互作用蛋白,并具有一定的生物学功能,为今后深入研究cAMP调控MKK7-JNK通路奠定了基础,为揭示cAMP促肿瘤细胞存活机制研究提供了新思路。