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目的探讨新型STAT3抑制剂SC99的体外抗血小板作用及其可能的机制,评估其与阿司匹林联用的体外协同抗血小板作用及其安全性。方法本研究以C57BL/6系小鼠体外洗涤血小板为研究对象,利用胶原诱导其发生聚集,观察不同浓度胶原以及在不同时相刺激下对JAK2/STAT3信号通路蛋白磷酸化的影响,并用该信号通路选择性抑制剂AG490和SC99作用后观察血小板最大聚集率的变化和对相关蛋白分子磷酸化的影响。利用STAT3信号通路特异性蛋白分子抑制剂SykI和SC99,通过血小板聚集率测定、免疫印迹法和免疫共沉淀共同验证蛋白分子Syk、STAT3、PLCγ2在该信号通路中的上下游关系,并检测在炎症刺激因子IL-6作用下SC99对STAT3信号活化影响。综合运用血小板聚集率测定、动态影像观察体外血凝块回缩、流式细胞检测血小板的释放活化和凋亡以及计算小鼠尾静脉出血时间,探讨阿司匹林和SC99联合应用的协同抗血小板作用及其安全性评估。结果1.不同浓度胶原刺激小鼠体外血小板聚集,发现2μg/ml浓度下p-STAT3和p-JAK2表达最高(P<0.05);2μg/ml胶原刺激血小板2min时p-JAK2表达高于其他时点(P<0.05),5min时p-STAT3表达至高峰(P<0.05);分别用AG490(0、25、50、100μM)预处理血小板,AG490组与对照组比较最大聚集率分别下降13%、25%、66%,各组差异有统计学意义(P<0.05),p-JAK2、p-STAT3、p-P65和p-AKT表达随AG490浓度增加逐渐减弱(P<0.05),p-c-Src表达无显著变化(P>0.05);50μM AG490预处理血小板,胶原(1、2、5μg/ml)诱导聚集,AG490组与对照组比较最大聚集率分别下降65%、27%、16%,各组差异有统计学意义(P<0.05);分别以SC99(0、1.25、2.5、5.0μM)预处理血小板,SC99组与对照组比较最大聚集率分别下降13%、34%、63%,各组差异有统计学意义(P<0.05),p-JAK2和p-STAT3表达随SC99浓度增加逐渐减弱(P<0.05),而p-P65、p-AKT和p-c-Src表达无显著变化(P>0.05);2.5μM SC99预处理血小板,胶原(1、2、5μg/ml)诱导聚集,SC99组与对照组比较最大聚集率分别下降67%、37%、18%,各组差异有统计学意义(P<0.05)。2.分别用Syk I(0、0.05、0.5、5μM)预处理血小板,Syk I组与对照组比较最大聚集率分别下降5%、23%、47%,各组差异有统计学意义(P<0.05),同时发现p-STAT3、p-PLCγ2的表达随SykI浓度增加逐渐减弱(P<0.05);0.5μM SykI预处理的血小板,胶原(1、2、5μg/ml)诱导聚集,Syk I组与对照组比较最大聚集率分别下降56%、36%、23%,各组差异有统计学意义(P<0.05);分别用SC99(0、1.25、2.5、5μM)预处理血小板,发现随SC99浓度增加p-PLCγ2表达逐渐减弱(P<0.05),而p-Syk表达无明显变化(P>0.05);用STAT3抗体免疫共沉淀发现STAT3与Syk和PLCγ2具有明显结合,利用PLCγ2抗体免疫共沉淀发现PLCγ2与STAT3和Syk也具有结合,STAT3和PLCγ2分别能与p-PLCγ2和p-STAT3抗体结合,P值均<0.05;SC99(0、1.25、2.5、5μM)预处理血小板后,PLCγ2抗体结合的p-STAT3随SC99浓度增加而降低(P<0.05);与IL-6相比较,IL-6+sIL-6R复合物可显著诱导p-STAT3的表达(P<0.05),且血小板p-STAT3表达程度随IL-6+s IL-6R复合物剂量增加而增加(P<0.05),该作用可被SC99所抑制(P<0.05)。3.分别以ASA 2mM、ASA(2mM)+SC99(2.5μM)、ASA 5mM预处理血小板,与对照组比较最大聚集率分别下降15%、61%、64%,后两组比较无统计学差异(P>0.05),余组间比较差异有统计学意义(P<0.05);血小板血栓回缩实验组内比较发现对照组、ASA(5mM)组、SC99(5μM)组各时点间差异均有统计学意义(P<0.05),ASA(5mM)+SC99(5μM)组各时点无统计学差异(P>0.05);组间比较10min、20min、30min时ASA(5mM)组和SC99(5μM)组差异无统计学意义(P>0.05),余组间差异均有统计学意义(P<0.05);ASA+SC99组抑制了22.6%的血小板表面P-selectin表达以及36.3%的integrinαⅡbβ3表达,结果与ASA组比较差异有统计学意义(P<0.05);ASA+SC99组血小板凋亡gate数以及凋亡蛋白相关的表达与ASA(5mM)组比较差异均无统计学意义(P>0.05);ASA+SC99组小鼠尾静脉出血时间(326.6±42.9 s)与ASA组(307.0±36.9 s)比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.胶原诱导的C57BL/6小鼠体外血小板聚集与JAK2/STAT3信号通路活化相关,该通路抑制剂AG490和SC99均能抑制血小板聚集,而SC99的分子信号特异性高于AG490。2.STAT3作为蛋白支架促使Syk对PLC2的活化,胶原和IL-6以STAT3为中间分子搭建了炎症因子相关性的共同信号通路,并可被SC99抑制。3.SC99与ASA联合应用对体外血小板聚集的抑制具有协同作用,与对照组比较能有效抑制血小板释放、活化以及血栓回缩,未显著影响血小板凋亡和凝血功能。