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背景：癌干细胞（cancer stem cells，CSCs）是近几年干细胞研究领域的热点，癌干细胞理论的提出，为临床靶向治疗肿瘤指明了方向，也为根治肿瘤带来了契机。癌干细胞理论认为癌干细胞是存在于肿瘤细胞中的极少部分细胞，具有无限增殖能力和分化潜能及较强的自我更新能力，与肿瘤的发生、耐药、转移及复发有着密切的关系。癌干细胞在肿瘤细胞中的比例极低，以至于给癌干细胞特性的研究带来了困难，在这样的困境之下，如何富集纯化癌干细胞就显得尤为重要。目前，国内外主要通过癌干细胞的耐药特性、自我更新及增殖能力并结合癌干细胞的相关标志物来富集和分选癌干细胞，常用的方法有耐药培养筛选、免疫磁珠分选法（magnetic Activated cell sorting，MACS）、流式细胞分选法（fluoresc-ence-activated cell sorting，FACS）、侧群细胞(side population，SP)分选法、条件培养分选等，但这几种方法都有其缺陷。耐药细胞分选是利用癌干细胞的耐药特性，用化疗药物低剂量干预从而达到富集癌干细胞的目的，但是在长期的抗化疗过程中可能会导致肿瘤干细胞表面标记物和癌干特性的改变，而不利于癌干细胞原本生物学特性的研究。免疫磁珠分选法及流式细胞分选法都需要结合癌干细胞特异性的标志物，通过这两种方法来富集和分选癌干细胞的难题就在于表面标记物的确定，由于癌干细胞缺乏特异性的表面标记物，这就限制了此两种方法的发展。侧群细胞分选方法是利用Hoecsht33342核酸染料与肿瘤细胞相互做用，Hoecsht33342在紫外光激发下能发出蓝色荧光，由于肿瘤干细胞表面含有耐药基因ABCG2，能将核酸染料Hoecsht33342泵出细胞体外而表现出低染或者不染的情况，再利用流式细胞仪根据肿瘤细胞染色的强弱分选出这部分不染或低染的细胞，但由此获得的肿瘤干细胞的纯度被越来越多的研究者质疑。条件培养分选即悬浮球培养筛选，是在无血清的培养基中加入适量表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子取代胎牛血清，这两种因子被证实对干细胞有促增殖抑制分化的作用，无血清干细胞培养保持了干细胞的未分化状态，癌干细胞在无血清培养基条件下可以长期存活而非癌干细胞则不能，以此来富集筛选癌干细胞，但是悬浮培养分选方法完全改变了癌干细胞的生长条件，可能不利于癌干细胞干性的发挥。近几年研究者们提出采用单细胞培养富集癌干细胞，根据细胞克隆形态可将单细胞克隆分为全克隆(holoclone, H)、部分克隆(meroclone, M)和旁克隆(paraclone, P)，其中H被证实富含CSCs。在本研究中，本课题组基于癌干细胞的耐药特性，通过裸鼠体内阿霉素干预初步富集了人肝癌细胞系BEL-7404中的癌干细胞特性细胞群，建立了耐药细胞系BEL-7404-ADM-P4，但由此得到的癌干样细胞比例仍然很低，并没有达到预期结果。为了探寻更有效的富集癌干细胞的方法，在后续的研究中，本课题组选用亲本细胞BEL-7404和耐药细胞系BEL-7404-ADM-P4细胞进行有限稀释单细胞培养构建了三种形态的肝癌干细胞克隆并对其癌干特性进行检测，以期能筛选出含高比例肝癌干细胞样细胞的克隆富集模式，为进行后续的癌干细胞研究提供坚实的实验基础。目的：以肝癌细胞BEL-7404为研究对象，基于肿瘤耐药特性裸鼠体内阿霉素干预建立耐药细胞系；观察亲本细胞BEL-7404及耐药细胞系BEL-7404-ADM-P4单细胞培养形成的三种克隆及其癌干特性检测的差异，以期能筛选出含高比例肝癌干细胞克隆的富集模式。方法：选取人肝癌BEL-7404细胞系为研究对象，基于肿瘤耐药特性裸鼠体内建立耐药细胞系，继而联合体外单细胞培养构建肝癌干细胞富集模式。其实验方法如下：⑴裸鼠体内阿霉素干预建立耐药细胞系：人肝癌细胞系BEL-7404裸鼠皮下移植瘤动物模型，采用阿霉素（8mg/kg）每周一次尾静脉注射，待肿瘤直径为1.5cm时取材进行原代培养，并在体内连续传代4次，将第4代肿瘤细胞命名为BEL-7404-ADM-P4。⑵体外单细胞培养富集肝癌干细胞样细胞：取亲本细胞系BEL-7404及耐药细胞系BEL-7404-ADM-P4，采用有限稀释法进行单细胞克隆培养，12天时在倒置显微镜下观察，根据形态分类，将克隆分为三种类型，即全克隆、部分克隆和旁克隆。三种克隆癌干特性检测：（1）增殖能力检测：①单细胞克隆生长曲线；②再次克隆形成实验：比较不同类型克隆的克隆形成率及不同克隆类型的构成比；③悬浮球形成实验：比较不同类型克隆悬浮球形成率；（2）耐药实验：Hoechst33342燃料外排情况；（3）实时荧光定量PCR检测癌干特性标志物；（4）裸鼠成瘤实验。结果：（1）裸鼠体内低剂量阿霉素干预,在体内连续成瘤传代过程中,裸鼠皮下移植瘤成瘤率均为100%,且成瘤时间从第一代到第四代均有所缩短,耐药倍数BEL-7404-ADM-P4是亲本BEL-7404的22倍，耐药细胞系建系成功;（2）增殖能力:①单细胞克隆生长曲线：全克隆增殖速度最快,细胞量最大,部分克隆次之,旁克隆增殖速度最慢,并于第10天开始出现细胞皱缩死亡;②克隆形成率:BEL-7404、 BEL-7404-H、BEL-7404-M、BEL-7404-ADM-P4、BEL-7404-ADM-P4-H、BEL-7404-ADM-P4-M克隆形成率分别为(72.03±1.54)%、(80.67±1.80)%、(68.90±1.28)%、(74.13±7.64)%、(84.77±1.46)%、(69.60±3.32)%， BEL-7404-ADM-P4-H高于BEL-7404、BEL-7404-H、BEL-7404-M、及BEL-7404-ADM-P4-M, P<0.05,差异有统计学意义;且其在BEL-7404-H、BEL-7404-M、BEL-7404-ADM-P4-H及BEL-7404-ADM-P4-M再次克隆形成实验中，BEL-7404-ADM-P4-H的全克隆构成比高于BEL-7404，P<0.05,差异有统计学意义；③悬浮球形成率:仅BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4-H可形成悬浮球,其余细胞系不形成悬浮球,BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4-H悬浮球形成率分别为（8.79±5.62）%、（13.78±10.49）%，而BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4-H悬浮球形成率比较, P>0.05,无统计学意义;（3）耐药实验：从BEL-7404-H、 BEL-7404-M、 BEL-7404-P、BEL-7404-ADM-P4-H、 BEL-7404-ADM-P4-M、 BEL-7404-ADM-P4-Phoechst33342染色情况，我们发现BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4-H中都有极少数不染和低染的细胞存在,而其他克隆均被染色，且BEL-7404-Hhoechst33342荧光强度强于BEL-7404-ADM-P4-H。（4）实时荧光定量PCR检测癌干特性标志物情况：取BEL-7404、BEL-7404-H、BEL-7404-ADM-P4及BEL-7404-ADM-P4-H细胞系共检测5个癌干特性表面标志物，有ABCG2、ALDH1A3、CD44、CXCR4、OCT4，其中ABCG2、CD44、CXCR4在BEL-7404-ADM-P4-H的表达高于BEL-7404、BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4，P<0.05,差异有统计学意义;而各细胞系ALDH1A3、OCT4表达无明显差异。(5)裸鼠成瘤实验：在BEL-7404、BEL-7404-H、BEL-7404-M、BEL-7404-ADM-P4、BEL-7404-ADM-P4-H及BEL-7404-ADM-P4-M的成瘤实验中，在细胞量为1.0×104条件下，仅BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4-H有裸鼠成瘤，BEL-7404-H及BEL-7404-ADM-P4-H的裸鼠成瘤率分别为1/8及7/8，BEL-7404-ADM-P4-H的裸鼠成瘤率高于BEL-7404-H，P<0.05,差异有统计学意义；且BEL-7404-ADM-P4-H瘤体Ki67的表达强于BEL-7404-H，P<0.05,差异有统计学意义。结论：①基于肿瘤耐药特性裸鼠体内阿霉素干预耐药细胞系建系成功；②耐药细胞系BEL-7404-ADM-P4-H表现出更强的自我更新和增殖能力、耐药性及致瘤性；③基于癌干细胞的耐药特性联合单细胞培养方法所形成的克隆亚群中,经阿霉素在体干预传代的耐药细胞系所形成的全克隆BEL-7404-ADM-P4-H可能含有更高比例的肝癌干细胞；化疗药物干预联合单细胞培养模式可为肝癌干细胞的富集和分选提供新的研究平台。