目的：全球癌症病人发病率及死亡率呈逐年上升趋势，手术、放疗和化疗仍是临床上治疗肿瘤的三大主要手段，而晚期癌症病人及非实体瘤病人大多只能选择放、化疗治疗。骨髓抑制是放、化疗最常见的毒副反应，主要表现为白细胞减少，甚至可使全血细胞减少，严重影响了患者的治疗效果。因此，如何有效增强骨髓抑制后再生是临床上肿瘤治疗中决定成败的一个焦点问题。临床上常用的升白细胞药物有两大类。西药有以粒细胞集落刺激因子(G-CSF)为主的一类药。国家药监局已批准上市的中药类有：地榆升白片、复方皂矾丸、升白合剂等十余种。因其各有弊端使它们在临床的应用中受到局限。锦囊升白冲剂系齐锦生教授多年临床随访观察经验总结，疗效显著，总有效率可达94%。是耐受放、化疗治疗极具临床开发前景的升白细胞新药。骨髓抑制后再生的细胞基础是造血干细胞（Hematopoietic stemcell,HSC），HSC通过不断的自我更新，不仅维持自身数量的恒定，且通过分化成各系祖细胞满足外周血造血需求。近年来研究发现一些内在因素对HSC自我更新具有强大的调控能力，如经典的WNT信号途径、NOTCH信号途径、同源盒(HOX)转录因子家族等可以调控HSC的自我更新能力。目前认为，NOTCH和WNT信号通路之间存在相互联系和协调平衡，WNT信号通路的高度活化是造血祖细胞增殖的重要条件，NOTCH通路对于维持造血祖细胞的未分化状态和休眠是必须的。HOX基因是同源盒基因(homeobox gene)家族中的一员，是一类在进化上高度保守的基因，HOX基因不仅调控正常造血增殖分化过程，其异常表达与白血病密切相关。此外一些小分子介质，如前列腺素E2(PGE2)，在调节HSC自我更新上起着重要化学调节作用，PGE2和WNT信号通路相互作用，通过活化WNT信号通路促进HSC的自我更新。在锦囊升白冲剂安全有效的临床应用基础上，本研究通过检测大量受辐射后白细胞减少的小鼠饮用锦囊升白冲剂后，外周血白细胞的变化，证明其有显著升高白细胞作用后；采用PCR和Western blotting技术筛查各组小鼠骨髓单个核细胞调节造血信号通路的基因：β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的mRNA水平和蛋白含量的变化，以探求白细胞减少症模型小鼠饮用锦囊升白冲剂后外周血白细胞升高的机制。本实验还应用PGE2合成酶COX2的特异性抑制剂celecoxib(塞来昔布)，通过抑制PGE2的合成，以探求锦囊升白冲剂在促进小鼠造血功能恢复过程中，是否是通过PGE2作用于WNT信号通路而发挥主要作用。为了进一步探求锦囊升白组方的有效成份亦或存在起效的单体成份，对该组方进行了分离纯化，这对阐明该药物作用分子机制和开发有重要意义。第一部分锦囊升白冲剂对放化疗后骨髓抑制再生的分子机制研究方法：1动物分组与取材健康雄性小鼠(20±5g)140只，昆明种，随机分为五组：地榆升白组、锦囊升白组、塞来昔布+锦囊升白组(塞+锦组)、病理对照组、正常对照组。正常对照组小鼠20只，余四组每组30只。前四组共120只小鼠(1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，直线加速器Ｘ线照射小鼠后肢双侧股骨，距离100cm，总剂量为4Gy，照射后1天检测白细胞，白细胞降至5×109.L-1以下为造模成功)，造模成功后小鼠80只，每组20只。以上五组正常饮食喂养，病理对照组和正常对照组自由饮水，前三组(地榆升白组给予地榆升白片、锦囊升白组给予锦囊升白冲剂、塞+锦组给予锦囊升白冲剂+塞来昔布胶囊)按人与动物单位体重折算的等效剂量计算小鼠的每日用药量，以小鼠每天的生理需水量溶解，配成相应浓度的药液给小鼠饮用，连续给药8天。2小鼠外周血细胞的检测和血清中PGE2值检测小鼠在室温20-25℃下喂养，给药第4天、第8天，每组取20只小鼠以内眦取血法采集小鼠抗凝血20μl，用血细胞分析器检测外周血细胞数值，同时在给药第8天每组取20只小鼠以内眦取血法，每只小鼠采抗凝血200μl，室温自然凝固后取血清测PGE2值。3骨髓单个核细胞β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的转录水平的检测实验结束后颈椎脱臼分组处死小鼠后，用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，收集细胞后用于提取总RNA和蛋白用于PCR和Westernblotting等分子生物学检测。Trizol法提取骨髓单个核细胞中总RNA，用β-actin做内参，PCR法检测β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2的mRNA表达。4骨髓单个核细胞β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2的蛋白含量用Lowry法测定蛋白含量，Western blotting检测骨髓中β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2的蛋白含量。随后对锦囊升白组方进行进一步分离纯化，再用各分离纯化得到的组分给造模成功后的小鼠饮用，观察各组分的有效性，从而寻求该中药组方的有效作用部位。并用分离纯化后得到的有效组份进行二极管阵列检测器和蒸发光检测器检测，通过定性分析以求明确其有效成份。结果：1小鼠的一般表现，锦囊升白冲剂对小鼠外周血白细胞和状态的影响给药第4天，地榆升白组(6.8±2.84)、锦囊升白组(5.47±1.79)较病理对照组(4.82±2.11)外周血白细胞数显著升高(P<0.05)。锦囊升白组较地榆升白组小鼠活动性强，被毛顺滑更有光泽。塞+锦组(3.85±0.79)与病理对照组(4.82±2.11)相比白细胞计数无统计学差异。塞+锦组(3.85±0.79)和病理对照组一般状态最差，动物开始活动减少，精神萎靡，闭目，尾、耳颜色苍白，被毛粗乱、蓬松且无光泽，体重随饮食量减少而下降。给药第8天地榆升白组(8.0±3.01)、锦囊升白组(7.99±2.75)较病理对照组(4.74±2.36)外周血白细胞数有显著差异(P<0.05)。塞+锦组(3.77±1.74)与病理对照组(4.74±2.36)相比白细胞计数无统计学差异。2小鼠血清PGE2浓度检测ELISA法检测小鼠血清PGE2浓度结果：锦囊升白组、地榆升白组和病理对照组相比PGE2浓度明显增高(P<0.05)。塞+锦组与病理对照组无明显统计学差异。3骨髓单个核细胞β-Catenin、NOTCH1、JAGGED1、HOXB4、COX2转录水平的变化地榆升白组COX2的mRNA表达(0.1194±0.00795)和锦囊升白组COX2的mRNA表达(0.0953±0.01274)相对病理对照组(0.0377±0.00564)均明显增高。锦囊升白组的JAGGED1mRNA表达(0.2628±0.01855)相对病理对照组(0.0429±0.00704)明显增高。锦囊升白组β-Catenin的mRNA表达(0.3935±0.12128)相对病理对照组(0.423±0.0186)，无明显统计学差异。锦囊升白组HOXB4的mRNA表达(0.0795±0.01407)相对正常对照组(0.0757±0.0135)，无明显统计学差异。4骨髓单个核细胞β-Catenin、JAGGED1、HOXB4、COX2蛋白含量的变化地榆升白组COX2的蛋白表达(0.7963±0.099)和锦囊升白组COX2的蛋白表达(0.7074±0.0842)相对病理对照组(0.2697±0.0324)有显著差异(P<0.01)。锦囊升白组(0.4901±0.0308)、塞+锦组(0.2433±0.0129)的JAGGED1的蛋白表达相对病理对照组(0.1017±0.0078)有显著差异(P<0.01)。地榆升白组的β-Catenin蛋白表达(0.8366±0.1143)和锦囊升白组β-Catenin的蛋白表达(0.4268±0.0352)相对病理对照组(0.0979±0.0151)，有显著差异(P<0.01)。锦囊升白组的HOXB4蛋白表达(0.203±0.013)相对正常对照组(0.2249±0.0193)无明显统计学差异。第二部分锦囊升白组方有效成份的分离方法：1锦囊升白组方有效成份的分离、纯化中药水煎后水相部分加有机溶剂萃取，药渣部分用适量95%乙醇浸泡24小时后药液倒出留用，药渣部分再用同等量95%乙醇浸泡10小时，两次的药液为乙醇相，乙醇相60-65℃悬蒸浓缩2小时，再用水浴锅干燥后放入烤箱80℃进一步干燥为粉末。有机溶剂萃取：第一步：加常压下沸程为60-90℃石油醚萃取两次，石油醚相40-45℃悬蒸浓缩2小时，再用水浴锅干燥后放入烤箱80℃进一步干燥为粉末。第二步：石油醚萃取后水相部分加沸点为61℃的氯仿萃取两次，氯仿相40-45℃悬蒸浓缩2小时，再用水浴锅干燥后放入烤箱80℃进一步干燥为粉末。第三步：氯仿萃取后水相部分加乙酸乙酯萃取两次，乙酸乙酯相40-45℃悬蒸浓缩2小时，再用水浴锅干燥后放入烤箱80℃进一步干燥为粉末。第四步：乙酸乙酯萃取后水相部分用正丁醇萃取两次，正丁醇相70-78℃悬蒸浓缩2小时，再用水浴锅干燥后放入烤箱80℃进一步干燥为粉末。正丁醇萃取后水相部分用水浴锅干燥后放入烤箱80℃进一步干燥为粉末。2实验动物和分组健康雄性小鼠(20±5g)230只，昆明种，随机分为八组：石油醚组、氯仿组、乙酸乙酯组、正丁醇组、水相组、乙醇组、病理对照组、正常对照组。正常对照组每组20只，余七组每组30只。前七组共210只小鼠（1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，直线加速器放射源照射小鼠后肢双侧股骨，距离100cm，总剂量为4Gy，照射后1天检测白细胞，白细胞降至5×109.L-1以下为造模成功）。造模成功后前七组每组选取小鼠20只，以上八组正常饮食喂养，病理对照组和正常对照组自由饮水，前六组(石油醚组、氯仿组、乙酸乙酯组、正丁醇组、水相组、乙醇组)按人与动物单位体重折算的等效剂量计算小鼠的用药量，以小鼠每天的生理需水量溶解，配成相应浓度的药液给小鼠饮用，连续给药8天。3小鼠外周血细胞的检测给药第8天每组取20只小鼠采内眦静脉抗凝血20μl，用血细胞自动计数仪检测外周血细胞变化。4液相色谱检测器检测已分离物质取氯仿相、乙酸乙酯相、水相组三相物质用二极管阵列检测器检测是否存在紫外吸收的化合物，用蒸发光检测器检测没有紫外吸收的有机物质。结果：1小鼠的一般表现，锦囊升白组方各分离成份对小鼠外周血白细胞和状态的影响给药第8天，氯仿组(11.97±4.65)、乙酸乙酯组(12.44±5.13)、水相组(17.39±6.38)较病理对照组(4.27±2.12)外周血白细胞数上升差值显著升高(P<0.05)。氯仿组、乙酸乙酯组、水相组较病理对照组小鼠活动性强，被毛顺滑更有光泽。石油醚组(6.61±1.96)、正丁醇组(5.29±1.79)、乙醇初提组(7.2±2.78)与病理对照组(4.27±2.12)相比白细胞计数无统计学差异，这几组动物开始活动减少，精神萎靡，闭目，尾、耳颜色苍白，被毛粗乱、蓬松且无光泽，体重随饮食量减少而下降。2药物分离纯化后成分的定性分析二极管阵列检测器(选200—400波长)检测表明：氯仿、乙酸乙酯、水相三个组无明显区别，波型类似，不存在紫外吸收物质。蒸发光检测器515X2(alteeh)检测不挥发分子，确定不存在紫外吸收物质(多糖无紫外吸收）；醇沉为5000以上大分子，沉的不多，其大部分物质为5000以下的小分子量多糖。结论：1锦囊升白冲剂使骨髓抑制后的小鼠外周血白细胞数显著升高。2锦囊升白冲剂升白细胞的机制是：活化COX2，产生高浓度PGE2，作用于WNT信号通路的β-Catenin，促进HSC增殖。3锦囊升白冲剂使骨髓单个核细胞JAGGED1表达增加，提示其能活化NOTCH信号通路促进造血恢复。4锦囊升白组方药物分离定性分析表明，其有效药物成份为5000以下的小分子量多糖。