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1、研究背景乳腺癌被公认为是女性癌症死亡的首要原因。尽管早期诊断和有效治疗极大的降低了致死率,但是仍有很大一部分患者在治疗过程中出现了明显的耐药和复发现象。近年来,伴随着肿瘤干细胞学说研究的兴起,越来越多的研究证据表明,乳腺癌肿瘤干细胞是乳腺癌中极少数的一部分具有自我更新及多向分化潜能的特殊群体,这一群体驱动肿瘤对化疗药物产生抵抗并与治疗后期出现的转移及复发息息相关。所以,寻找针对肿瘤干细胞治疗的特异性靶点,将为恶性肿瘤的治疗开辟一条新的途径。信号枢纽蛋白p62作为一种多结构域多功能蛋白,主要通过与Raptor,TRAF6,RIP1和Keap1等多种信号分子相互作用,广泛参与细胞内多种信号通路的调控(例如m TOR,NF-κB和NRF2)。众多的研究结果表明,多种常见恶性实体瘤(包括乳腺癌)中都存在p62蛋白的异常过表达,但p62如何调控乳腺癌的发生发展,以及p62蛋白的表达与乳腺癌肿瘤干细胞干性的关系,尚无系统合理的论证,需要我们去进一步深入探索和研究。2、研究方法(1)(1)通过ALDH1+细胞群流式分选,获得乳腺癌肿瘤干细胞群体,通过Western blot和RT-q PCR实验,比较ALDH1+与ALDH1-群体中p62(SQSTM1)基因和蛋白的表达情况;(2)通过微球悬浮培养实验,获得乳腺癌干细胞群体,比较“干性”微球与普通贴壁细胞两组之间p62的差异表达情况。(2)(1)通过ALDH1阳性分析,比较敲降或高表达p62的情况下,乳腺癌细胞中ALDH1阳性比例的变化;(2)通过体外微球悬浮培养,比较干预p62表达对乳腺癌细胞微球形成能力(直径、数目)的影响。(3)体内实验:(1)通过ALDH1+流式分选的方法,分别从对照组(sh NC)和敲降p62(shp62)的MDA-MB-231细胞中分离出具有“干性”的细胞,并通过RT-q PCR验证两组干性相关基因表达情况;(2)分别从两组ALDH1+群体中取等量的5×104细胞接种于NOD/SCID雌鼠皮下(每组6只),培养6周后比较两组的成瘤率和肿瘤体积。(4)(1)通过基因表达谱芯片(AFFYMETRIX Human Primeview)对移植瘤组织进行表达谱测序(每组进行三次独立重复测序);(2)将表达谱测序结果(>1.5倍)与干细胞基因集进行比较分析差异表达基因;(3)从基因和蛋白水平分别对移植瘤组织中伴随p62变化的下游靶标进行验证;(4)通过对表达谱测序结果进行基因集富集分析(GSEA),进一步验证p62与下游靶标分子之间的关系。(5)(1)在乳腺癌细胞系中对p62基因进行瞬时敲降(干扰序列si#1、si#2)以及外源性瞬时过表达,从基因和蛋白水平检测上述所发现的差异表达基因的变化;(2)引入耐受表柔比星的MCF-7(Epi R-MCF-7)细胞系作为高表达干性特征的细胞模型,通过体外微球悬浮培养,将高表达靶标基因的Epi R-MCF-7-shp62组与Epi R-MCF-7-shp62组的微球形成大小和数目进行比较。(6)(1)构建该差异表达基因的报告基因载体,通过双荧光素酶报告基因实验,检测p62蛋白对该差异表达基因的启动子活性有无影响;(2)将细胞系用放线菌素D处理,处理时间分别为0、30、60和90分钟,收集样品检测p62蛋白对该重要基因mRNA半衰期的影响;(3)通过RNA-IP实验检测p62蛋白是否可与该差异表达基因的mRNA直接结合;(4)若p62蛋白与该差异表达基因之间没有结合,则进一步探索可调控该差异表达基因mRNA稳定性的中间分子(例如micro RNA家族),通过RT-q PCR和Western blot方法进行验证。3、研究结果(1)p62在乳腺癌干细胞中的表达情况:(1)RT-q PCR和Western blot检测结果显示,相较于ALDH1-组,ALDH1+细胞中p62的表达量更高,差别有统计学意义(P<0.05);(2)RT-q PCR和Western blot检测结果显示,微球中p62基因和蛋白的表达量显著高于贴壁培养细胞,且差别有统计学意义(P<0.001)。(2)体外细胞学研究结果:(1)ALDH1+流式分析结果显示,ALDH1+群体所占比例随p62表达量的下降而下降,随p62表达量的升高而升高;(2)体外微球悬浮培养结果显示,敲降p62可显著降低乳腺癌MDA-MB-231细胞一代、二代微球形成能力(微球直径变小、数目减少);高表达p62可增加MCF-7细胞一代、二代微球形成能力。(3)体内功能学研究结果:(1)RT-q PCR检测结果显示,通过ALDH1+流式分选方法获得的“干性”群体中,shp62组中p62,NANOG,SOX2和POU5F1的mRNA表达水平明显低于sh NC组,差别有统计学意义(P<0.001);(2)MDA-MB-231对照组成瘤率为100%(6/6);敲降p62组,成瘤率为83.3%(5/6);且相较于对照组,p62敲降组的肿瘤体积明显减小,差别有统计学意义(P<0.001)。(4)(1)(2)根据表达谱芯片测序结果(>1.5倍)与干细胞基因集进行比对,我们共得到28个差异表达基因(NLE1,SRSF3,POLD2,TDP2,HSPA9,CHEK1,NUDT1,RFC5,ITGB3BP,MCM6,ARL4A,LUC7L3,CUL4A,MCM3,SET,NOG,SP1,HMGB1,MRE11A,POLR1C,RFC3,SNCRIP,MCM4,GMNN,MYC,PBX1);(3)通过RT-q PCR和Western blot进行验证,结果显示:shp62组中MYC基因的表达水平显著低于sh NC组,差别有统计学意义(P<0.001);(4)GSEA结果显示,shp62组MYC下游靶基因表达水平显著低于sh NC组。(5)(1)在乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、BT-549、SKBR-3)对p62基因进行瞬时敲降,可下调MYC基因mRNA水平及c-Myc蛋白水平;瞬时高表达p62(MDA-MB-231、MCF-7)可上调MYC基因mRNA水平及c-Myc蛋白水平;(2)微球悬浮培养结果表明,在Epi R-MCF-7-shp62细胞中重建MYC高表达能够逆转因敲降p62所造成的微球形成数目少、体积小的情况。(6)(1)Luciferase实验结果显示,p62的高表达没能引起荧光素酶活性的明显变化(P>0.05)(MDA-MB-231、MCF-7);(2)放线菌素D抑制实验结果显示,对照组MDA-MB-231细胞中MYC基因mRNA的半衰期为38.68分钟;高表达p62可使MYC基因mRNA的半衰期延长至70.88分钟;(3)对RNA-IP所得样品进行RT-PCR检测,结果显示,p62与同型对照(Ig G)组均未检测到MYC基因mRNA的存在;(4)RT-q PCR结果显示,高表达p62后,let-7家族中let-7a和let-7b的表达水平受到抑制;在p62高表达组中加入let-7a/b的模拟物,可观察到对照组和实验组中MYC基因和蛋白的表达水平均显著下降。4、研究结论(1)在乳腺癌干细胞干性群体中,p62基因和蛋白表达水平均明显升高;(2)p62对乳腺癌干细胞干性的维护起到重要的作用;(3)干预p62表达可引起MYC基因mRNA水平的变化;MYC在p62调控乳腺癌干细胞干性中扮演重要角色;(4)p62稳定MYC基因的mRNA水平,主要通过抑制let-7a/b的表达。