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[目 的]利用体外灌流生物反应器及大鼠全肝脱细胞支架,为hUC-MSCs提供体外培养和诱导分化微环境,通过检测肝细胞相关分子表达以及肝细胞相关功能来评估hUC-MSCs的肝向分化情况,以探索静水压对hUC-MSCs肝向分化的影响,寻找hUC-MSCs肝向分化的最适条件。[方 法]1、hUC-MSCs体外培养与鉴定:无菌条件下,组织贴壁法分离培养hUC-MSCs,细胞培养至第四代,用流式细胞术检测细胞特异分子CD34、CD90、CD45、CD105、OCT4表达情况;采用成脂、成骨分化鉴定细胞多向分化能力。2、用SDS法制备大鼠全肝脱细胞支架,并检测脱细胞支架的质量。检测静水压对脱细胞支架内hUC-MSCs肝样分化的影响,实验分组为阴性对照组、二维诱导组(常规细胞培养板培养)、三维静止诱导组(细胞种植在脱细胞支架上,不施加压力)和三维持续灌流培养诱导组(细胞种植在脱细胞支架上,持续施加10cmH2O压力),培养21天后收集细胞检测肝细胞相关因子(ALB、AFP、CK18、CK19、CYP3A5)的表达情况、肝细胞功能、力学-整合素信号通路相关分子(整合素β1、p-FAK、LamininA/C)的表达情况。[结 果]1、组织贴壁法分离培养得到hUC-MSCs,经流式细胞术检测细胞高表达CD105(98.9%± 1.35%)、CD90(99.17%±0.94%),极低表达 CD34(0.06%±0.04%)、CD45(0.19%±0.27%),部分表达 OCT4(65.7%±3.25%),符合hUC-MSCs的特点;成脂分化后,油红O染色可见细胞内脂滴形成,成骨分化后茜素红染色可见钙结节形成,说明hUC-MSCs可分化为成脂和成骨细胞。2、用SDS法制备全肝脱细胞支架,残余DNA含量(12.79±0.90 ng/mg组织)显著低于正常肝组织(4987.60±310.29 ng/mg组织),H&E及电镜检测未见残余细胞,能够为MSCs的体外培养提供良好生长环境。3、与二维培养条件相比,三维培养条件下的细胞在mRNA及蛋白水平均表达更高的肝细胞相关标志物(ALB、AFP、CK18、CK19、CYP3A5),且具有更强的肝细胞相关功能(糖原合成、分泌ALB、ALP)。另外,三维持续灌流培养诱导条件下的肝样细胞相关因子的表达及肝细胞相关功能显著高于三维静态培养。4、在hUC-MSCs的肝向分化过程中,力学-整合素信号通路相关分子(整合素β1、p-FAK、LamininA/C)的表达降低,与二维培养条件相比,在三维培养条件下的信号通路相关分子表达显著降低。[结 论]1、利用组织块贴壁法成功分离培养出符合hUC-MSCs特点的细胞。2、hUC-MSCs可在3D及3D10 cmH2O静水压的条件下诱导分化为肝样细胞,全肝脱细胞支架能够为hUC-MSCs的体外培养和肝向诱导分化提供良好的三维生长环境,促进hUC-MSCs的肝样分化。3、10 cmH2O的静水压能够促进hUC-MSCs在3D条件下的肝样分化,使其分化为更成熟、更接近肝细胞功能的肝样细胞。4、在hUC-MSCs肝样分化过程中,力学-整合素信号通路受到抑制。