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小麦全蚀病是由小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var.tritici Walker）引起的一种分布较广、为害性较强的世界性病害,该病为一种土传病害,一旦发生较难根除。天名精内酯酮是一种倍半萜内酯类化合物,广泛分布于菊科天名精属植物中,对小麦全蚀病菌具有显著抑制作用,具有进一步开发利用的价值,但该化合物对小麦全蚀病菌的抑菌机制尚不清楚。课题组前期经荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫金法亚细胞定位等研究中发现天名精内酯酮在小麦全蚀病菌中作用的细胞器为线粒体,且对生物氧化有一定影响。本研究以小麦全蚀病菌为供试菌株,从组织病理学观测、生化与分子生物学水平研究以及同源模建与分子对接等手段对天名精内酯酮作用靶标进行初步鉴定。取得如下主要结果:1、测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的抑菌活性以及与线粒体呼吸链旁路呼吸酶抑制剂水杨肟酸（SHAM）的增效作用。结果表明:天名精内酯酮对小麦全蚀病菌有显著的抑制作用,EC50为40.30μg/mL。天名精内酯酮与SHAM的共毒系数为146.1显著大于120,表明天名精内酯酮与SHAM有显著增效作用。因此,推测天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链有显著抑制作用。2、测定天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链复合酶I、II、III、IV、V、I+III、II+III以及柠檬酸合酶（CS）的浓度和时间效应,并通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析了相关酶基因mRNA的相对表达量。结果表明:天名精内酯酮处理供试菌株后,呼吸链复合酶活性受到不同程度的抑制,尤其是复合酶III、I+III和II+III。EC30、EC50和EC70浓度处理下,天名精内酯酮可致供试菌株呼吸链复合酶III的活性分别降低了约30%、60%、87%,复合酶I+III的活性分别降低了26%、45%和76%,复合酶II+III的活性分别降低了50%、60%、85%。供试菌株呼吸链复合酶III、I+III和II+III的活性与天名精内酯酮处理浓度和时间呈负相关;且线粒体呼吸链复合酶III基因GgCyc对天名精内酯酮较为敏感。由此推测呼吸链复合酶III是天名精内酯酮潜在靶蛋白之一。3、建立小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系,并将潮霉素磷酸转移酶基因（hph）转入供试菌株基因组DNA中。结果表明:小麦全蚀病菌产生原生质体较佳条件为:1 mL1.4%裂解酶中,0.035 g菌丝在31℃、90 rpm酶解2.2 h,产生的原生质体为9.83×107原生质体/mL,原生质体活力达到96.27%。在此条件下转化hph,转化率为46-54个转化子/μg DNA。小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系的建立为构建小麦全蚀病菌突变菌库奠定基础。4、构建成功供试菌株呼吸链复合酶III基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp的RNAi以及过表达突变菌株,并进一步测定了突变菌株菌丝生长速率、菌落形态以及对H2O2和天名精内酯酮的敏感性。结果表明:沉默突变菌株?GgCytc1、?GgCytb和?GgIsp的菌丝变细,端部分枝减少,菌丝生长速率较慢,对H2O2产生的氧化压敏感性有一定程度降低。沉默突变菌株?GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显著降低,EC50为156.18μg/mL,而过表达突变菌株OEIsp对天名精内酯酮较为敏感EC50为25.88μg/mL。由此推测,复合酶III铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮潜在靶标之一。5、测定野生型菌株及突变菌株的黑色素含量、过氧化物酶、漆酶、菌株致病性、离体和活体条件下呼吸链复合酶III活性以及线粒体氧消耗速率。结果表明:（1）与野生型和过表达菌株相比,天名精内酯酮（100μg/mL）处理后,沉默菌株?GgCytc1、?GgCytb、?GgIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1（实验室保存）的黑色素含量显著增加（约50-100%）。（2）天名精内酯酮EC80处理后,野生型菌株及突变菌株的过氧化物酶活性显著增加,而?GgIsp的过氧化物酶活性与对照相比无显著差异。?GgCytc1、?GgCytb、?GgIsp和24-HN-1的漆酶活性显著降低（约47,37,41和44%）,其致病力较弱与漆酶活性一致。（3）在离体条件下,用天名精内酯酮(0、EC20、EC80)处理后,除了?GgIsp和24-HN-1呼吸链复合酶III活性并无显著变化,其余菌株呼吸链复合酶III活性均显著降低;在活体条件下,天名精内酯酮EC20处理后,呼吸链复合酶III活性均有一定程度增加,EC80处理后,复合酶III活性显著受到抑制,但是?GgIsp和24-HN-1呼吸链复合酶III活性变化并不显著。（4）抗霉素A（20μg/mL）处理菌株后,小麦全蚀病菌野生型菌株、?GgCytc1、?GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体氧消耗速率显著受到抑制（约95、89、92、58、92、92和88%）,而沉默突变菌株?GgCytb的线粒体氧消耗速率无明显变化;天名精内酯酮(EC80)处理菌株后,小麦全蚀病菌野生型菌株、?GgCytc1、?GgCytb、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体氧消耗速率显著受到抑制（约81、77、78、58、72、73和70%）,而沉默突变菌株?GgIsp的线粒体氧消耗速率无显著变化。由上述结果推测铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮的潜在靶标之一。6、以酵母（Saccharomyces cerevisiae）呼吸链复合酶III细胞色素c1（Cytc1）,细胞色素b（Cytb）和铁硫蛋白（ISP）亚基的三维结构为模板,通过SWISS-MODEL软件对供试菌株Cytc1、Cytb和ISP亚基进行了同源模建以及活性腔预测,并将天名精内酯酮分别与Cytc1、Cytb和ISP亚基的活性腔进行分子对接。结果表明:Cytc1、Cytb和ISP亚基活性腔中的八个氨基酸残基（Tyr200、Arg194、Gly47、Gln43、Leu225、Arg171、Gln166和Tyr230）可能为天名精内酯酮的结合位点。综上所述,天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链有显著抑制作用,且呼吸链复合酶III是其潜在的靶蛋白之一。结合课题组前期研究结果推测天名精内酯酮作用机制为:天名精内酯酮在供试菌株线粒体中富集,影响呼吸链复合酶活性,尤其是复合酶III,阻断呼吸链电子传递,致能量形成受阻,线粒体中积累大量ROS,引起供试菌株一系列的氧化胁迫,最终线粒体释放凋亡因子,引起细胞凋亡而达到抑菌目的。