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磁性复合微粒是由高分子或无机材料与磁性超细粉末(如铁的氧化物、铁、钴、镍等金属)构成的具有超顺磁性的胶态复合材料。近年来,结合磁性氧化物粒子和胶体金特点,Fe3O4/Au组成的无机·无机磁性复合微粒(简称金磁微粒)成为研究热点。由于具有粒径小,比表面积大,超顺磁性及可修饰生物分子等特性,借助外加磁场的使用,这种新型磁性复合微粒已被用于免疫学检测、酶的固定化、蛋白分离等领域。以课题组自主研制的金磁微粒为载体,本文建立了全血基因组DNA纯化方法,并对相关问题进行系统探讨。
以人全血、猪血、大鼠血液等为样本,通过对纯化过程中裂解条件、结合体系、金磁微粒用量及非特异性吸附杂质的清洗、DNA洗脱等环节的优化,,建立了从哺乳动物全血中纯化基因组DNA的方法。通过紫外吸收检测、电泳分析、PCR扩增等手段对方法的可靠性(包括得率、纯度、批内差、批间差等)进行了评价,证实纯化得到的DNA可满足PCR扩增实验的要求。此外,以鸡血为样本,对纯化体系进行适当的调整,建立了禽类动物全血基因组DNA纯化方法。结果表明:从100μL人全血中可纯化得到基因组DNA为2~5μg,从5μL鸡全血中可得到基因组DNA约20μg,其A260/280值均在1.70~1.90之间,纯化所得DNA分子结构完整;同一批次金磁微粒纯化得到DNA得率批内差小于7%,三个不同批次金磁微粒纯化得到DNA得率的批间差小于20%。整个纯化过程可在50 min内完成,操作简单、不涉及酚,氯仿等有毒试剂,可与国外同类纯化方法相媲美。
在金磁微粒为载体的DNA纯化体系建立过程中,发现存在一定的背景值,即以超纯水替代血样完成的操作过程,其洗脱液在260 nm处亦有较小特征吸收,对比发现国外同类产品也存在不同程度的背景值。据此,对产生背景的主要原因作了分析,结果表明,金磁微粒组成中的表面铁的组分和洗脱液中的EDTA形成金属螯合物的反应可能是导致背景值的主要原因,升高温度可以加速该反应。对比Fe3O4磁粒和金磁微粒,结果表明单纯Fe3O4磁粒的空白背景(在260 nm处吸收峰)是金磁微粒的10倍以上,表明Au对Fe3O4的修饰可以很大程度上降低EDTA对Fe3O4的螯合作用,减少背景的影响。以Tris—HCl作为洗脱液或TE缓冲液的常温洗脱可有效去除该背景值。