内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)是真核细胞中重要的细胞器，对细胞内外环境的改变极为敏感，氧化应激、缺血损伤、钙稳态紊乱以及正常或错误折叠蛋白质高表达均可引起其功能紊乱，当细胞内外的因素打破了蛋白质合成、成熟与降解之间的稳态，出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态，称为内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress， ERS)。 ERS早期主要是糖调节蛋白78(glucose-regulated proteins78，GRP78)、GRP94、钙网蛋白、CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein，CHOP)等蛋白表达上调。现有研究表明，ERS分子主要参与细胞的分化与凋亡调节。而ERS分子是否也参与细胞的功能调控，目前还不清楚。有证据表明，GRP78和CHOP可能参与了调节IP3R的活性，影响ER内Ca2+的释放，从而可能参与调节脓毒性休克血管内皮细胞骨架的重构，引起血管通透性的改变。而内毒素休克模型中血管通透性的改变是否与内质网应激相关，内质网应激分子GRP78、CHOP是否通过IP3受体途径改变细胞内钙离子的浓度，参与休克血管通透性改变的调节，需要进一步研究。据此，本研究利用脓毒性休克大鼠内质网应激模型，研究GRP78和CHOP蛋白表达的变化及其与血管通透性改变的关系。体外毒胡萝卜素诱导肺血管内皮细胞内质网应激，探讨细胞水平内质网应激与IP3受体介导钙离子浓度改变引起细胞通透性改变的关系。主要实验方法：实验分为体内实验和体外实验。体内实验：盲肠结扎穿孔法诱导脓毒性休克，建立大鼠内质网应激模型，按照盲肠结扎穿孔后时间长短分为五组，CLP1h组，CLP2h组，CLP4h组，CLP6h组,CLP8h组，将其与空白对照组，CLP6h+牛磺酸处理组一起构成实验分组。牛磺酸200mg/kg(4%牛磺酸溶解于0.9%的生理盐水)于CLP术前经由股静脉注入大鼠体内，分光光度计法测量渗漏在肺组织血管外的异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白，检测各组大鼠内质网应激血管通透性改变。Western Blot法测量肺血管内GRP78和CHOP蛋白的表达，统计学分析GRP78和CHOP蛋白的表达与血管通透性改变的相关性。Western Blot法测量各组大鼠肺血管内IP3受体蛋白的表达变化，利用钙探针钙离子成像方法检测血管内钙离子含量，将得到的各组蛋白含量、钙离子浓度、血管通透性变化进行统计学分析，从而探讨脓毒性休克内质网应激是否通过IP3钙离子通路调节血管通透性。体外实验：用4只成年健康大鼠的肺动脉主干取血管内皮片进行血管内皮细胞原代培养及传代，体外毒胡萝卜素诱导肺血管内皮细胞内质网应激，在细胞培养基中加入2μmol/L毒胡萝卜素，分别作用1、2、4、6、8小时。按照毒胡萝卜素作用时间长短分为1h、2h、4h、6h、8h组。Transwell法测量各组血管内皮细胞通透性改变，激光共聚焦检测F-actin形态及分布，Western Blot法测量细胞内IP3受体蛋白表达，钙探针法检测细胞内钙离子浓度改变，并用统计学分析得出血管内皮细胞通透性、IP3受体蛋白、细胞内钙离子浓度三者改变的相关性，了解内质网应激引发的血管通透性改变与IP3受体钙离子通路的相关性。主要研究结果：1．体内实验(1)脓毒性休克大鼠血管通透性及内质网相关蛋白表达变化：CLP术后1h，各组反应肺血管通透性的荧光渗透率开始升高。随着时间的延长，盲肠造瘘术组肺血管荧光物质渗透率逐渐升高，术后8小时达到高峰；CLP术后1h，GRP78蛋白、CHOP蛋白的表达开始升高，随着术后时间的延长，GRP78和CHOP蛋白表达持续上升。统计学分析显示，脓毒性休克大鼠各组反应血管通透性的荧光物质渗透率指标与GRP78和CHOP蛋白表达含量呈显著正相关。(2)血管内皮细胞应力纤维变化：CLP术后1h，通过鬼笔环肽染色，各组脓毒性休克大鼠肺动脉主干提取的内皮细胞可见F-actin主要分布在细胞膜的周边，向外突出呈毛刺状，细胞质内可见密集的应力纤维，随着作用时间的延长，细胞形态出现变化，应力纤维变多，出现不规则排列，向周边的毛刺状突起明显增多。对照组F-actin表达不明显，细胞形态较规则。(3)IP3受体表达：脓毒性休克大鼠肺组织中IP3R-I蛋白的表达也随休克时间延长而增加。CLP术后1h，大鼠肺组织IP3R-I蛋白表达量较对照组增加，随着术后时间的延长，IP3R-I蛋白表达持续上升，呈递增趋势。统计学分析表明，GRP78和CHOP蛋白的表达与IP3R-I表达呈正相关。(4)脓毒性休克大鼠血管内皮细胞钙离子浓度变化：CLP1h后，脓毒性休克大鼠肺血管内皮细胞中钙离子浓度较对照组增加，随着术后时间的延长，内皮细胞钙离子浓度显著上升。内质网应激分子蛋白与钙离子浓度变化呈正相关，IP3R-I表达与钙离子浓度变化也呈正相关。(5)牛磺酸干预作用：与CLP6h组进行比较，牛磺酸干预组各项指标出现明显的下降趋势，CLP术前给予牛磺酸(200mg/kg，股静脉注入)，6h后与单纯CLP组6h进行比较。牛磺酸干预后，血管通透性荧光渗透率较单纯CLP6h组降低，GRP78、CHOP和IP3R蛋白的表达较单纯CLP6h组显著下调，钙离子浓度也较CLP6h组显著降低。2.体外实验(1)血管通透性与内质网应激相关蛋白表达变化：随着毒胡萝卜素作用时间的延长，血管通透性及内质网应激相关分子表达均呈递增趋势，在细胞培养基中加入2μmol/L毒胡萝卜素作用1h，各组反应肺血管通透性的荧光渗透率即开始升高。随着作用时间的延长，肺血管荧光物质渗透率呈线性递增。同样，GRP78和CHOP蛋白亦随毒胡萝卜素作用时间延长呈线性递增，结合统计学分析提示，毒胡萝卜素诱导的血管内皮细胞内质网应激与细胞通透性改变相关。(2)肺血管内皮细胞应力纤维改变：毒胡萝卜素作用1h后，通过鬼笔环肽染色，各组肺血管内皮细胞可见F-actin主要分布在细胞膜的周边，向外突出呈毛刺状，细胞质内可见密集的应力纤维，随着作用时间的延长，细胞形态出现变化，应力纤维形成增多，向周边的毛刺状突起更明显，对照组F-actin表达不明显，细胞形态较规则。(3)肺血管内皮细胞内钙离子浓度变化和IP3R受体蛋白的表达：毒胡萝卜素作用内皮细胞1h后，IP3受体蛋白的表达与细胞内钙离子浓度均升高，随着作用时间的延长，IP3R-I蛋白表达及内皮细胞钙离子浓度均持续上升，呈递增趋势，组间比较显示有统计学意义(p<0.05，p<0.05)，结合内质网应激分子及肺血管内皮细胞通透性相关性分析，提示IP3受体钙离子通路途径可能参与内质网应激导致血管通透性改变的调节。(4)牛磺酸干预作用：在细胞培养基中注入200ml/L牛磺酸，在注入毒胡萝卜素作用肺血管内皮细胞后，与单纯毒胡萝卜素作用6h组进行比较，各项指标出现明显的下降趋势。牛磺酸和毒胡萝卜素共同作用6h后与单纯毒胡萝卜素诱导组6h进行比较，牛磺酸干预后，血管通透性较单纯毒胡萝卜素6h组降低，GRP78、CHOP蛋白的表达较单纯毒胡萝卜素作用6h组显著下调。结论：1.脓毒性休克可诱导血管内皮细胞发生内质网应激。内质网应激参与了休克后血管通透性增高的发生，内质网应激分子GRP78和CHOP蛋白为休克后血管通透性升高的重要参与分子。2.内质网应激相关分子GRP78和CHOP蛋白可能主要通过IP3受体途径升高细胞内钙离子浓度，从而调节血管内皮细胞应激纤维形成，调节血管通透性。