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微RNA病毒(Picornavirus)感染细胞后,破坏细胞内物质的双向运输,细胞内膜被重构成以磷脂酰肌醇-4-磷酸(Phosphatidylinositol-4-phosphate,PI4P)为主的膜环境。在重构的细胞膜结构上,病毒通过其非结构蛋白招募特定细胞蛋白在细胞内膜上形成病毒复制复合物,这是微RNA病毒有效复制的基础。PI4P是由磷脂酰肌醇-4-激酶IIIβ亚基(Phosphatidylinositol-4-kinase IIIβ,PI4KB)催化生成,因此,病毒蛋白招募PI4KB到达复制位点对病毒的复制至关重要。微RNA病毒招募PI4KB的分子机制,是近几年病毒学研究的热点。微RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp,又称3Dpol)的生物学功能是复制病毒的RNA,因此,3Dpol是病毒复制复合物的核心。研究复制复合物的形成是了解病毒在感染细胞中复制过程的重要方面。口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的传染病,给牛羊猪等偶蹄动物养殖业造成巨大的经济损失。FMDV是一种微RNA病毒,其显著特点是复制速度快和宿主嗜性范围广,这可能与病毒独特的复制特性有关。本研究旨在探讨FMDV在感染细胞中招募PI4KB的机制以及病毒复制复合物的形成。在IBRS-2细胞中,特异性沉默内源性PI4KB的表达,可抑制FMDV非结构蛋白3A的表达、降低病毒复制的滴度以及抑制病毒基因组的复制;相反,PI4KB的过表达可促进3A的表达、提升病毒的滴度以及提高病毒基因组的复制。这些结果表明,PI4KB是FMDV复制所必需的细胞蛋白。Co-IP和GST pulldown实验证实,FMDV 3A与PI4KB存在间接的相互作用;在FMDV感染细胞中,3A与内源性PI4KB共定位于复制位点,表明FMDV 3A间接招募PI4KB到达病毒复制位点,暗示存在其它蛋白介导3A招募PI4KB。进一步的研究发现,FMDV 3A和PI4KB都直接相互作用于细胞蛋白酰基辅酶A含3结合域(Acyl-Co-A Binding Domain containing 3,ACBD3)的羧基端GOLD结构域;GST pulldown竞争实验证实,3A与ACBD3结合的亲和性高于ACBD3与PI4KB的结合,这些结果表明3A竞争性结合ACBD3-PI4KB中的ACBD3,暗示ACBD3介导3A招募PI4KB。然而,沉默IBRS-2细胞内ACBD3的表达并不损害FMDV 3A与PI4KB的共定位以及FMDV的复制,说明ACBD3对于3A招募PI4KB是非必需的。这些结果提示,存在未知的蛋白介导FMDV 3A招募PI4KB到达病毒的复制位点。在筛选与FMDV 3Dpol相互作用的细胞蛋白过程中,PI4KB被鉴定为与3Dpol相互作用的候选蛋白。Co-IP和GST pulldown证实FMDV3Dpol与PI4KB存在直接相互作用;在FMDV感染细胞过程中,3Dpol与内源性PI4KB共定位于病毒的复制位点;另外,FMDV 3Dpol与3A之间也存在相互作用。这些结果表明,在FMDV复制位点可形成至少包含3A、3Dpol和PI4KB的复制复合物,此复合物的形成是FMDV有效复制的前提。概括起来,本研究有三个贡献点:FMDV 3A招募PI4KB到达病毒复制位点,后者是病毒复制所必需的;尽管3A竞争性结合ACBD3-PI4KB中的ACBD3,但是ACBD3对于3A招募PI4KB是非必需的;在FMDV感染细胞中3A-3Dpol-PI4KB复制复合物形成于病毒复制位点,这是病毒进入细胞后发生复制的前提条件。