论文部分内容阅读
Nel样蛋白1(NELL-1)是一个与颅缝早闭相关的新型分泌蛋白。作为一个可能的生长因子，NELL-1与骨软骨世系有高度特异性，在包括啮齿类和其他大型动物的多种机体模型中对骨发育有全面的诱导作用。本研究从NELL-1的上游调控基因及相互作用蛋白的鉴定等方面，旨在完善对这一骨诱导生长因子功能机制的理解。启动子分析显示，在人NELL-1转录起始位点上游的5＇端有一簇跨越大约70个bp(从-71位到-142位)的潜在Sp1位点(Sp1/Osterix结合位点)。当在入骨肉瘤细胞Saos2中过表达Osterix时，NELL-1启动子报告系统中的荧光素酶活性显著降低。突变分析表明这种抑制作用是被Sp1位点介导的。利用体外EMSA和体内ChIP分析确证了在Saos2细胞及原代人成骨细胞中Osterix与Sp1位点的特异性结合。同时ChIP分析也表明Osterix通过影响RNA聚合酶Ⅱ与NELL-1启动子的结合而下调NELL-1，并不是通过与Runx2竞争结合OSE2位点。而且当Osterix在Saos2，U2OS，Hela及Glioma(神经胶质瘤)细胞中过表达时，NELL-1的mRNA水平都显著降低。与之相应的，在Saos2及原代人成骨细胞中敲除Osterix能够增加NELL-1转录及成骨细胞分化。这些结果说明了Osterix是一个直接的对NELL-1基因表达起抑制作用的转录调节因子，制衡着Runx2对NELL-1转录的调控功能，可能在成骨细胞的分化及矿化中扮演重要角色。这一发现帮助我们加深了对于Runx2，Osterix及NELL-1分子机制的理解，阐释了它们在骨发育过程中的相互作用。在对NELL-1受体及结合蛋白鉴定进行探索的过程中，我们成功建立起一种基于噬菌体展示技术的筛选方法。为进一步进行NELL-1互作蛋白研究奠定了基础。通过构建人骨肉瘤细胞Saos2 eDNA片段集合的噬菌体展示文库，利用生物淘选方法鉴定出具有细胞增殖抑制作用的膜相关蛋白APR3是NELL-1的结合蛋白。运用免疫共沉淀及激光共聚焦对共定位的观察，确认了共同过表达的NELL-1与APR3具有直接的物理结合，并共定位于人成骨细胞的细胞核表面。细胞增殖分析表明NELL-1通过与APR3共转染进一步下调Cyclin D1表达，从而显著抑制成骨细胞增殖。二者的共同表达增强了骨标记基因Ocn及Bsp的mRNA水平，增加了细胞矿化。利用APR3特异性的siRNA敲除内源性APR3能够抑制NELL-1对成骨细胞分化的促进作用。这些发现表明NELL-1对成骨细胞分化及增殖的影响一定程度上是通过与APR3结合来起作用的。