几丁质及其水解产物在病虫害防治、医药生产和饲料加工等多个领域具有广泛的用途,其专一性水解酶——几丁质酶(chitinase)已成为当前研究的热点,分离新的几丁质酶基因、构建高效表达工程菌,对实现几丁质酶产业化具有重要意义。本文通过对哈茨木霉进行诱导产几丁质酶,采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定其酶活性,发现有1株菌株产几丁质酶活力较强。根据GenBank中多种真菌几丁质酶氨基酸序列的保守区设计特异性兼并引物,利用RT-PCR和3’/5’RACE技术从高产几丁质酶菌株—哈茨木霉中克隆出完整的几丁质酶基因。该基因cDNA全长1517bp,5’端和3’端非翻译区长度分别为47bp和177bp,开放阅读框为1293bp;以哈茨木霉基因组DNA为模版,通过PCR扩增发现含有3个内含子。编码430个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸。其对应的氨基酸序列具有几丁质酶18家族的2个高度保守的活性区域：几丁质结合区域SXGG和酶作用活性位点DXXDXDXE。构建几丁质酶基因高效表达真核载体pPIC9K-Thchit44,电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达,培养液中几丁质酶的活力可达58.6U/ml,较哈茨木霉几丁质酶活力(23.5U/ml)提高2.49倍。经SDS-PAGE获得44kD重组目的蛋白,与理论预测值一致。综上所述,本文已成功地从哈茨木霉中分离出几丁质酶Thchit44基因,并构建了高效真核表达载体pPIC9K-Thchit44,同时优化了该工程菌诱导表达的参数,这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶的产业化生产奠定了良好的前期工作基础。