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多种杆状病毒中存在类芋螺毒素(ctx)基因,与海洋生物-芋螺中的ω-芋螺毒素具有类似的半胱氨酸基序(CX3GX2CX5CCX3CX6C)。通过氨基酸序列的同源性比对分析,发现在21种杆状病毒中存在28个CTX序列,其中6种杆状病毒分别包含2个或2个以上CTX序列,其开放读码框的长度大约为48-68个氨基酸残基。Eldridge等对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)中的CTX进行了研究,证明了CTX多肽产物的存在,但未发现其功能。虽然家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV,BmNPV)与AcMNPV同源性很高,但在BmNPV中并没有发现ctx基因。因此,本实验通过构建含ctx基因的重组病毒BmNPVs和AcMNPVs,对ctx基因进行研究。
通过PCR扩增AcMNPV中的ctr基因。利用KnpI和BamHI双酶切转移质粒pFastBacl,插入该基因;另外,利用SnaBI和BamHI切除多角体启动子,置换上iel启动子,构建在iel启动子驱动下表达外源基因的重组病毒。本实验利用BmNPV杆粒系统分别构建了多角体启动子和iel启动子驱动下的重组穿梭载体Bm-pFastBacl-Piel-ctx,Bm-pFastBacl-ph-ctx和Bm-pFastBacl-ph-ctx-eGFP;同时,利用AcMNPV杆粒系统构建了重组病毒Ac-pFastBacl-Piel-ctx和Ac-pFastBacl-Piel-ctx-eGFP。
为分析ctx基因产物在细胞中的定位,以eGFP为报告基因,将其连接到ctx的3端,分别以BmNPV和AcMNPV杆粒作为载体来表达融合蛋白CTX-eGFP。在共聚焦扫描显微镜下观察发现,荧光信号主要集中在细胞膜上,说明该蛋白是分泌型的,与其含信号肽序列的特征相符。
为研究ctr表达产物的功能,分别用重组病毒Bm-pFastBacl-Piel-ctx,Bm-pFastBacl-ph-ctx和野生型BmNPV感染家蚕细胞(BmN),Ac-pFastBacl-Piel-ctx和AcMNPV感染Tn细胞。感染3天后,发现细胞出现病变。收集细胞液,做虫体实验,结果发现,与野生型病毒相比,重组病毒BmNPVs具有明显的抑制家蚕幼虫和蛹血液黑化的作用。同时,以重组病毒AcMNPVs做抑菌活性分析,结果表明,Ac-pFastBacl-Piel-ctx对金黄色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢杆菌等临床致病菌有显著的抑制作用,说明在细胞中过表达的CTX多肽能分泌到胞外,具有抑菌活性。
通过上述实验,发现CTX产物是一种分泌型多肽,能够抑制家蚕幼虫和蛹的血液黑化,推测它具有多酚氧化酶抑制剂的功能;同时,CTX多肽对于一些致病菌具有抗菌功能。本实验首次提出杆状病毒的ctx基因产物具有多酚氧化酶抑制剂的功能,在病毒感染时起干扰虫体免疫反应的作用,可能更有利于病毒的增殖,但其分子机制仍需进一步实验证明。