研究背景抑郁症作为一种严重的神经精神类疾病,全球罹患人群超过2.64亿,已成为致残的主要因素。抑郁症发病机制极其复杂,涉及诸多脑区如前额叶、杏仁核、伏隔核、海马、外侧缰核、腹侧被盖区等以及它们之间相互连接的神经环路,因此抑郁症也被认为是一种“神经环路疾病”。目前,尽管在动物研究中已经报道了诸多神经环路与抑郁症相关,但这些神经环路还不够完善,不同的环路对于行为学表型的调控作用不尽相同:有的可以同时调节焦虑样和抑郁样的行为表型,而有的神经回路只能调节一种表型;有的环路是正向调节,而有的环路则是负向调节。抑郁症相关的神经网络组成的不完善和不同神经环路功能上的异质性依然有碍于我们对抑郁症病理机制的充分理解,也影响抑郁症治疗方法的开发。因此,发掘新的脑区及其神经环路对于进一步完善抑郁症相关的神经网络,揭示抑郁症的发病机制有着重要地意义。海马作为抑郁症研究重点关注的脑区之一,已经有大量的报道并取得了重要的进展。海马DG区存在一类被称为印记细胞的神经元,能够编码不同的情绪记忆,这些细胞的活性变化与焦虑样和抑郁样表型高度相关。同时,DG区的成体神经发生减弱,也会介导抑郁样症状的产生。海马CA1锥体神经的活动改变也对抑郁样的行为表型有重要的调控作用。然而,内嗅皮层作为海马与皮层及皮层下诸多脑区连接的门户,在抑郁症中的作用却被大大忽略。临床及动物研究提示内嗅皮层内的诸多变化,包括组织结构,神经活动,与其他脑区的功能连接,以及蛋白、分子层面的异常改变均与抑郁症高度相关,深部脑刺激靶向内嗅皮层,可以显著提升学习记忆并改善抑郁症状。但内嗅皮层及其相关的神经环路如何介导抑郁相关的行为表型依然不清楚。激活内嗅皮层浅层神经元及其传入到海马的神经投射可以有效促进海马DG区的神经发生以及整个海马的活化状态,从而缓解抑郁样的行为表型。接受海马传出的内嗅皮层深层,以及它向海马外诸多脑区的纤维投射是否也在抑郁中发挥重要作用暂无研究报道。研究目的因此,本研究聚焦于内嗅皮层主要负责向皮层及皮层下传出的Va亚层神经元及其向视觉皮层的主要神经投射,利用慢性社会挫败应激构建的抑郁样小鼠模型来研究Va亚层及其向视觉皮层的投射对抑郁样表型的作用以及可能的神经活动机制。研究方法（1）首先,我们运用顺行、逆行的病毒示踪策略以及组织形态学、荧光成像和定量分析的方法来详细了解内嗅皮层Va亚层神经元向顶部皮层的纤维投射的分布特点及其主要通路的特异性;（2）运用21天与10天慢性社会挫败应激范式构建抑郁样表型的小鼠模型并对两种范式的行为表型进行系统比较;之后再利用c-Fos免疫染色、脑组织透明化处理、光片荧光成像及定量分析相关技术探究21天慢性挫败应激对内嗅皮层Va的神经活动的影响;（3）在健康小鼠上,利用化学遗传抑制（h M4Di,Gi＿DREADD）和光遗传抑制（Arch T）的方法分别对内嗅皮层投射至次级视觉皮层内侧区（V2M）通路的Va神经元胞体及其轴突末梢模拟特异性地抑制该通路的神经活动并观测行为学的改变,以此来探究Ent→V2M通路对于介导抑郁样行为表型的必要性;（4）进一步,我们先利用携带Ch R2基因的AAV病毒标记小鼠的Ent→V2M通路,接着让小鼠经历21天慢性社会挫败应激而表现出抑郁样的行为表型,我们再利用光遗传激活小鼠Ent→V2M通路并观测行为学改变,以此来探究Ent→V2M通路激活对于介导抗抑郁样的行为表型是否具有充分性;（5）同时,为了明确光遗传的光是否会通过外周视觉通路而产生作用或者干扰,我们将光遗传的光阻断于颅骨外,使其不能进入皮层从而不能激活Ent→V2M通路,但依旧保留了颅骨外泄露的光,再观测小鼠行为学是否发生变化;另外,我们用不透明的眼罩将小鼠的正常视觉阻断,观测小鼠的外周视觉被阻断前后的行为学改变,以及在此条件下,再用光遗传激活Ent→V2M通路,观测小鼠行为学的进一步变化;（6）在明确了Ent→V2M通路对抑郁样表型的充分必要关系后,为了进一步探究Ent→V2M通路的神经活动是如何介导小鼠的行为表型的,我们利用由美国Janelia Research Campus的研究人员最新开发的基因编码Ca2+荧光指示剂（GECI）,j GCa MP7b,联合光纤光度测定技术,在测试小鼠行为学时同步记录Ent→V2M通路的神经活动,结合事件-信号关联的分析方法来揭示相关的神经活动机制;（7）为了阐明外周视觉通路的短暂干预（阻断或刺激）对行为学的影响的机制,我们将光纤记录的小鼠暴露于红光条件下并记录小鼠在高架十字迷宫测试和束缚测试时Ent→V2M通路的神经活动,并与小鼠处在正常白光条件下该通路的活动进行比较;另外,我们用LED闪光模拟光遗传激活时的光对小鼠的外周视觉给予刺激,同时观测Ent→V2M通路的神经活动对连续闪光的响应。研究结果1.内嗅皮层→视觉皮层通路的连接特点（1）顺行标记的结果显示,内嗅皮层Va亚层神经元投射到皮层的神经纤维有较为广泛的分布,但主要集中在同侧的顶部皮层靠尾侧的区域（绝大部分属于视觉皮层）;其中同侧次级视觉皮层内侧区（V2M）为内嗅皮层Va神经元纤维投射的密集区;（2）内嗅皮层Va神经元投射至顶部皮层的神经纤维主要集中于同侧视觉皮层的浅层（Ⅱ-Ⅲ层）;Ⅳ-Ⅴ层只有少量神经纤维分布,Ⅴ-Ⅵ层分布的神经纤维较Ⅳ-Ⅴ多,但均显著少于Ⅱ-Ⅲ层的神经纤维;（3）逆行标记的结果显示,投射至次级视觉皮层内侧区的神经纤维的确只来源于内嗅皮层Va亚层,而非内嗅皮层其他区域;并且投射至次级视觉皮层内侧区的内嗅皮层Va神经元绝大多数为同侧内嗅皮层的Va神经元,对侧内嗅皮层只有极少被标记的神经元;同侧被标记的神经元主要分布于内侧内嗅皮层,外侧内嗅内嗅皮层Va亚层也有一定量的神经元分布,但数量较少;（4）两种逆行病毒标记的结果显示,内嗅皮层Va投射至V2M的神经元,与内嗅皮层Va投射至其他脑区如前额叶、伏隔核、杏仁核的神经元只有少量共标（低于10%）,与投射至海马CA1的内嗅皮层神经元（位于内嗅皮层Ⅲ层）基本没有共标;2.慢性社会挫败应激致使内嗅皮层Va亚层神经活动受抑制（1）经过21天慢性社会挫败应激后,90%以上的小鼠为抑郁易感小鼠。易感小鼠与对照小鼠相比,其社会交互显著减少,社交回避增加;糖水偏好分数显著降低;强迫游泳不动时间增加;旷场测试中去中心区的时间和次数均显著减少,高架十字迷宫测试去开放臂的时间和次数;易感小鼠在旷场测试中的运动速度显著低于对照小鼠,但小鼠的运动速度与其在中心区停留的时间长短并无显著相关性;易感小鼠在悬尾测试中的不动时间较对照小鼠长,但统计差异不明显;两组小鼠的体重无显著差异;（2）21天范式的耐受比率（<10%）较10天范式（～30%）显著降低;与10天范式相比,21天范式的易感小鼠的行为表型改变更为显著,各行为指标具有更强的相关性并且对易感小鼠具有更好的预测效力;（3）c-Fos免疫荧光染色的结果显示,经过21天CSDS后的抑郁易感小鼠的内嗅皮层Va亚层的c-Fos数量显著少于对照组小鼠内嗅皮层Va亚层的数量;3.抑制Ent→V2M通路活动可以诱导健康小鼠产生抑郁样的行为表型（1）h M4Di特异标记投射至V2M的内嗅皮层Va神经元,经功能测试,h M4Di在与CNO结合后,可以有效抑制所标记神经元的活动;（2）利用CNO特异地将h M4Di小鼠投射至V2M的内嗅皮层Va神经元的活动抑制后,与m Cherry对照小鼠相比,h M4Di小鼠在三箱社会交互测试中与陌生小鼠的交互时间显著降低,回避增加;对糖水的偏好分数也显著降低;h M4Di小鼠在强迫游泳测试中的不动时间显著增加;在高架十字迷宫和旷场测试中,h M4Di小鼠去开放臂和中心区的时间和次数均显著减少;当两组小鼠均注射生理盐水时,h M4Di小鼠的糖水偏好与焦虑程度与m Cherry对照小鼠并无明显差异;尽管h M4Di小鼠注射CNO后在旷场测试中的运动速度显著低于m Cherry对照小鼠,但两组小鼠的运动速度与它们去中心区的时间并无显著相关性;而在三箱社会交互测试中,两组小鼠的运动速度并无显著差异,且运动速度与它们在社会交互区（S1）和空交互笼区（E1）的停留时间均没有显著的相关性;（3）Arch T标记小鼠在光遗传抑制Ent→V2M通路轴突末梢的神经活动时,与EYFP标记小鼠对比,在三箱社会交互测试中,与陌生小鼠交互的次数显著减低,在空交互笼区停留的时间显著增加;在高架十字迷宫测试中,Arch T小鼠去开放臂的时间显著减少;而在Ent→V2M通路的神经活动被光抑制前、后,两组小鼠去开放臂的时间均没有显著差异;光抑制时,Arch T小鼠去开放臂的时间与自身在给光前、后去开放臂的时间比较,显著减少;4.激活Ent→V2M通路快速缓解小鼠抑郁样的行为表型（1）携带Ch R2的病毒可以很好的标记Ent→V2M通路的轴突末梢,经功能测试,光遗传激活Ch R2标记的轴突末梢,可以稳定地引起突触后的神经元激活;（2）Ent→V2M通路表达Ch R2的小鼠,在经历21天CSDS后,与对照小鼠比较,抑郁易感小鼠的社会交互时间和社交指数显著降低,回避时间和回避指数显著增加,强迫游泳的不动时间显著增加,但在悬尾测试中的不动时间只略微增加,去高架十字迷宫开放臂和去旷场中心区的时间和次数均显著减少;当光遗传激活Ent→V2M通路时,两组小鼠各行为学指标之间的差异均被消除;当停止激活后,两组小鼠在大多数行为学指标又基本恢复之前的差异;对于抑郁易感小鼠,在Ent→V2M通路激活时,各行为指标均较激活之前、之后有显著地改善;对照组小鼠也有类似地改变;而EYFP小鼠在光遗传给光时在高架十字迷宫测试中去开放臂的时间,较给光前、后并无明显改变;Ent→V2M通路的激活也能促进正常小鼠在三箱社会交互测试中与陌生小鼠的交互,显著降低回避时间;（3）当阻断光遗传的光进入V2M时,抑郁易感小鼠与对照小鼠在社交交互测试、高架十字迷宫测试和旷场测试的行为学指标的差异均没有被消除;（4）抑郁易感小鼠在正常视觉被不透明的眼罩阻断后,在社会交互测试中在交互区停留的时间、在角落区停留的时间、去高架十字迷宫开放臂的时间,去旷场中心区的时间,与视觉被阻断前相比,均没有显著改变;而在带着眼罩的条件下,给光激活Ent→V2M通路,依旧能有效促进抑郁易感小鼠的社会交互、增加去开放臂和旷场中心区的时间;5.Ent→V2M通路活动的提升驱动小鼠向抗抑郁的状态转变（1）利用携带j GCa MP7b基因的病毒标记和光纤光度测定技术可以很好的采集到麻醉状态和清醒状态下小鼠Ent→V2M通路的Ca2+活动;（2）在高架十字迷宫中,随着Ent→V2M通路的Ca2+活动呈现持续上升,小鼠从闭合臂去到开放臂,而当Ent→V2M通路的Ca2+活动强度逐渐降低到初始水平,小鼠则从开放臂去到闭合臂;小鼠处于开放臂和中心区时,Ent→V2M通路的Ca2+活动强度显著高于小鼠处于闭合臂时的Ca2+活动强度;（3）在奖赏测试中,小鼠连续地舔舐奖赏（牛奶）,伴随着Ent→V2M通路Ca2+活动持续上升;当停止获取奖赏后,该通路的活动又会逐渐下降至初始水平;Ent→V2M通路Ca2+活动增强的幅值与小鼠舔舐牛奶的时间长短（或舔舐次数）并无显著相关性,表明这条通路的神经活动对运动并不响应;（4）Ent→V2M通路的Ca2+活动周期性的提升可以驱动小鼠在强迫游泳测试和束缚测试中周期性的反抗挣扎,而当Ent→V2M通路Ca2+活动处于较低水平时,小鼠则处于不动的屈从状态;Ent→V2M通路Ca2+活动上升比小鼠挣扎起始的时间点约早1 s左右;Ent→V2M通路的Ca2+活动对小鼠在跑步机上连续性的跑动和小鼠梳理自己的毛发并不响应;（5）在红光条件下,小鼠在高架十字迷宫测试和束缚测试时,Ent→V2M通路的Ca2+活动发放强度和变化趋势与小鼠在白光条件下做相同的测试比较,并无显著差异;模拟光遗传激活时LED节律性的闪光刺激小鼠的外周视觉并不能使Ent→V2M通路的Ca2+活动对其稳定响应。研究结论21天慢性社会挫败应激是一种更为高效的构建抑郁动物模型的范式;Ent→V2M通路作为一条投射特异的神经环路,在抑郁样表型的发生发展中发挥着重要的调控作用,极可能是抑郁症相关的一条关键神经环路。Ent→V2M通路作为一条由深部脑区（Ent）投射至皮层浅表（V2M浅层）的神经环路,为抑郁症的临床治疗尤其是一些对大脑无侵入性损伤的刺激治疗如经颅磁刺激和经颅直流电刺激等提供潜在有力的靶点。