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核酸等温扩增方法是一种快速、高效的扩增核酸序列的方法。扩增反应在恒定的温度下进行,相对于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)更为简单,不需要PCR仪等快速调节反应温度的仪器,因此在快速分析、试纸化检测和单细胞分析等方面具有重要的应用潜力,已经成为生物分析化学研究领域的前沿和热点。本论文从三个不同角度,发展了核酸等温扩增在血液循环miRNA检测、Cas9核酸酶剪切分析和细胞表面膜蛋白分析中的新应用,解决了传统生物分析方法中难以解决的一些问题,为生物分析技术的进步提供了新思路。具体的研究内容和主要成果如下:1、从血液中的循环miRNA难以被直接检测的问题出发,发展了一种数字化的三维液滴检测系统,实现了对结肠癌病人临床血浆样品中miRNA的超灵敏直接检测。使用微液滴包裹的方法,有效压制了血浆中杂质蛋白造成的背景信号,并实现数字化检测;利用等温指数扩增反应,实现了对液滴中miRNA分子的超灵敏分析;并结合三维荧光液滴检测技术,对血浆样品中100 copies/mL至100,000copies/mL范围内的miRNA进行直接、快速分析,检测过程无需分离纯化等样品前处理步骤,并能有效区分有单碱基差别的同家族miRNA。2、设计了一种新型的切口酶引发的核酸等温扩增反应,实现了对Cas9核酸酶剪切产物的高灵敏分析,并将该反应用于高特异性的指向RNA预筛选。通过在目标序列前增加切口酶位点的方法,设计了Cas9核酸酶剪切分析探针,解决了双链DNA难以直接引发核酸等温扩增反应的问题,实现了对10 pM的Cas9核酸酶剪切产物的快速分析。使用该方法对指向RNA进行优化筛选后,可以在细胞基因沉默实验中,实现对有单碱基差别的目标序列的有效区分。3、利用滚环扩增反应,构筑了能够在外界刺激下可逆伸缩的DNA纳米弹簧结构;并通过在DNA纳米弹簧上修饰能与细胞膜受体结合的多肽,构成多位点配体,用于调控细胞膜表面蛋白的功能。以滚环扩增反应产生的单链DNA骨架为基础,通过在骨架上设计长程重复的发卡型结构,并利用DNA链替换反应,实现了可逆伸缩的DNA纳米弹簧结构构筑。将多肽修饰后的纳米弹簧用于控制细胞膜表面蛋白(整合素)的聚集和分散,实现了对Hela细胞边缘丝状伪足形成的调控,并能够影响整合素控制的下游信号通路的mRNA表达。