孔雀石绿(malachite green,MG)及其代谢物隐孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)属于三苯甲烷类化合物,由于具有“三致”作用,对人和动物造成潜在危害,同时也影响生态环境,国家标准已明令规定在食品及饲料中不得检出。因此,建立快速、灵敏的检测方法对于加强孔雀石绿及其代谢物的监测具有重要意义。以单克隆抗体为核心材料的免疫分析法现已成为现代分析技术的主要手段之一。因此,本论文开展相关抗孔雀石绿及其代谢物隐孔雀石绿单克隆抗体制备和单残留、多残留免疫检测技术研究。主要研究内容及结果如下:　　 (1)隐孔雀石绿单克隆抗体制备及检测方法建立　　 基于手臂位点、长度及得失电子的差异,将LMG通过取代及缩合反应制备出15种LMG半抗原,并偶联蛋白制备人工抗原。通过对不同半抗原设计合成的抗原进行免疫动物实验,用ELISA方法对免疫结果进行检测,筛选高质量抗原。采用不同载体、不同偶联比进行所筛选抗原的优化,同时结合不同免疫剂量和免疫方式、免疫间隔周期进行动物免疫,建立最佳免疫方法,获得可以产生高质量抗体的小鼠。采用细胞融合制备单克隆抗体技术,制备抗隐孔雀石绿单克隆抗体LMG-DC4-A6,属于IgG1亚类。基于所制备单克隆抗体建立隐孔雀石绿ELISA检测方法,方法针对隐孔雀石绿的LOD(IC10)为0.07 ng/mL,IC50为1.16ng/mL,检测范围为0.1-8.1ng/mL(IC20 IC80),其检测线性回归方程为y=-0.3419LogX+0.526(R2=0.9928)。方法特异性好,与原药孔雀石绿交叉反应小于1％,与其它结构类似物之间几乎无交叉反应。对实际样品的添加回收率为62％-107％。经HPLC-MS-MS方法确证,该方法灵敏度高、回收率好、测定结果准确,试剂盒稳定性好,可以满足现有隐孔雀石绿的检测需求,产品己进入中试推广。　　 (2)孔雀石绿单克隆抗体制备及检测方法建立　　 以隐孔雀石绿半抗原为基础,选择区别较大的几个半抗原制备孔雀石绿半抗原,并偶联蛋白制备人工抗原。通过对不同半抗原设计合成的抗原进行免疫动物实验,ELASA方法对免疫结果进行检测,筛选高质量抗原。采用不同载体、不同偶联比进行筛选抗原的优化,结合不同免疫剂量、免疫间隔周期进行动物免疫,建立最佳免疫方案,获得可以产生高质量抗体的小鼠。采用细胞融合技术制备并筛选出抗孔雀石绿单克隆抗体MG-DA4-C7,属于IgM亚类,孔雀石绿ELISA检测方法针对孔雀石绿的方法IC50=0.96ng/mL,检测范围为0.1-8.1ng/ml(IC20-IC80),LOD=0.05 ng/mL。其检测范围线性回归方程为y=-0.3274Logx+0.4698(R2=0.9891)。方法特异性好,与代谢物隐孔雀石绿交叉反应小于0.1％,与有色三苯甲烷类药物有一定的交叉反应。对实际样品的添加回收率为78％-87.4％。经HPLC-MS-MS方法确证,该方法灵敏度高、回收率好、测定结果准确,试剂盒稳定性好,完全可以满足现有孔雀石绿的检测需求,产品已进入中试推广。　　 (3)孔雀石绿、隐孔雀石绿同时检测技术研究　　 基于所制备的隐孔雀石绿单克隆抗体和孔雀石绿单克隆抗体,在前期优化抗原的基础上,通过对两种抗体浓度及包被条件的优化,选择混合抗体方法进行隐孔雀石绿和孔雀石绿的同时测定。初步探索孔雀石绿及其代谢物的多残留icELISA方法,方法针对孔雀石绿和隐孔雀石绿的IC50为2.35-3.68ng/mL,LOD为0.23ng/mL,检测范围0.57-27.3ng/mL。试验对双特异性抗体的制备做了初步探索研究,对分泌隐孔雀石绿的杂交瘤细胞采用5.溴脱氧核苷尿嘧啶筛选培养,使细胞TK酶缺失,对分泌孔雀石绿的杂交瘤细胞采用8-氮嘌呤筛选HGPRT筛选培养,使细胞HGPRT酶缺陷,最终成功获得完全保持亲本性状的HGPRT酶缺陷型单克隆抗体HGPRT-1-MG-D4和TK-1-LMG-F3。　　 通过以上试验研究,本文成功建立孔雀石绿及其代谢物的ELISA检测方法。同时建立了不影响灵敏度和特异性的酶缺陷型杂交瘤细胞筛选体系和评价体系,为进一步研究双特异性单克隆抗体提供技术参考。