囊泡运输与细胞自噬是真核生物维持正常生命活动所必需的基本生理过程。囊泡运输是实现胞内物质转移的重要途径，而细胞自噬则是维持细胞稳态和应对环境因子的胁迫所必需的一类亚细胞降解途径。　　 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）体内的囊泡运输受到Ypt/Rab类小G蛋白(GTPase)的调控，而小G蛋白的活性又受到鸟苷酸交换因子(GEFs)和GTPase激活蛋白(GAPs)的调节。酿酒酵母中的转运蛋白颗粒(Transport Protein Particle，TRAPP)复合体是一类拴系因子，同时也是小G蛋白Ypt1和Ypt31/32的GEFs，可激活相应的小G蛋白。目前酵母中已报道的TRAPP复合体有三类:TRAPPⅠ、TRAPPⅡ和TRAPPⅢ，分别在内质网至高尔基体的囊泡运输、高尔基体内部及离开高尔基体的运输和细胞自噬过程中起作用。这些TRAPP复合体由六个共同的亚基(Bet3、Bet5、Trs20、Trs23、Trs31、Trs33)构成TRAPPⅠ核心复合体，在此基础上，TRAPPⅡ还含有Trs120、Trs130、Trs65和Tca17四个特异性亚基，TRAPPⅢ含有Trs85特异性亚基。这些亚基中，Bet3作为共有必需亚基，在囊泡运输中有着非常重要的作用;Trs65是一种只存在于真菌，而尚未在哺乳动物等高等真核生物中发现的蛋白，其主要起到组装和稳定TRAPPⅡ复合体的作用;而Trs85则主要作用于细胞自噬的启动过程。已有越来越多的证据显示小G蛋白及其GEFs除了在调控囊泡运输中发挥作用之外，也参与对细胞自噬过程的调节。但是，至今没有研究系统地比较TRAPP复合体的同一亚基在囊泡运输与细胞自噬过程中的不同功能及分析囊泡运输与细胞自噬过程之间的关联性。本论文将就三种具有代表性的TRAPP复合体亚基Bet3、Trs65和Trs85在囊泡运输和细胞自噬过程中的作用开展研究并进行比较，得到如下主要结果:　　 1.Trs65、Trs85及Bet3参与了胞内的囊泡运输利用四分体分离技术和直接敲除法得到了trs65Δ菌株、trs85Δts菌株和trs65Δtrs85Δts菌株，并对上述菌株的胞内Snc1蛋白所代表的囊泡运输情况进行了研究。结果发现，在营养丰富的条件下，TRS65敲除未引起Snc1运输的异常，TRS85敲除则引起了Snc1极性运输功能的丧失，在胞内呈弥散状;TRS65和TRS85双敲除所引起的囊泡运输缺陷较单敲除更为严重;通过利用荧光蛋白标记的胞内不同位点的标志蛋白和细胞活体染色技术，初步确认了TRS85敲除或TRS65和TRS85双敲除所引起的GFP-Snc1蛋白运输受阻于内质网(ER)，而从质膜向内体运输的内吞途径未受影响。在氮素营养缺乏条件下，TRS65敲除菌株细胞中Snc1向液泡的运输也出现了受阻现象。有关TRAPP复合体公用必需亚基Bet3参与囊泡运输的功能已有一些报道，本论文中进一步将CPY-GFP整合入bet3ts菌株，发现Bet3突变导致CPY在营养丰富条件和氮素营养缺乏条件下向液泡的运输均受阻，情况类似于Ypt1突变所引起的运输缺陷，说明Bet3亚基参与了CPY所代表的囊泡运输。　　 2.TRAPP复合体亚基突变所引起的生长、囊泡运输及液泡形态的异常可以通过其对应小G蛋白的过量表达来进行抑制在trs85Δts及trs65Δtrs85Δts等温敏感型菌株中过量表达调控物质进出高尔基体的小G蛋白Ypt1和Ypt31，发现突变体的高温敏感性、GFP-Snc1运输缺陷以及液泡的碎裂缺陷可以通过过量表达Ypt1而不是Ypt31进行抑制。这些结果与trs130ts菌株的高温敏感性、GFP-Snc1运输缺陷以及液泡的碎裂缺陷可以通过过量表达Ypt31而不是Ypt1进行抑制构成对应关系，表明TRAPP复合体亚基可通过其对应的小G蛋白调控相关的生理过程。　　 3.Trs65和Trs85参与了饥饿处理条件下非自噬蛋白向液泡的运输跟踪了非自噬蛋白GFP-Snc1和GFP-Snc1-PEM在饥饿条件下向液泡中运输的规律，发现TRS85敲除或TRS65和TRS85双敲除菌株对饥饿处理的响应速度较野生型和TRS65单敲除菌株慢，响应程度也明显低。当用FM4-64染料对饥饿处理20小时的GFP-Snc1-PEM整合菌株进行染色，发现TRS85敲除或TRS65和TRS85双敲除细胞的液泡内大部分为空的，而野生型和TRS65敲除细胞的液泡内充满了内容物。Trs65虽然不显著影响细胞自噬过程，但饥饿处理导致大量GFP-Snc1在trs65Δ细胞中的累积。这些结果说明Trs65和Trs85均参与响应饥饿处理后物质向液泡的定向运输过程。　　 4.Trs85或Trs65和Trs85共同参与了饥饿处理后单个圆形液泡的形成细胞饥饿处理后，随时间的进程，发现trs65Δ菌株、trs85Δts菌株、trs65Δtrs85Δts菌株及其野生型菌株细胞的液泡都有变成单个圆形液泡的趋势，但是在变化速度和程度上存在较大的差异。TRS85敲除和TRS65与TRS85双敲除菌株中最终单个圆形液泡率低于野生型菌株，经方差分析表明存在显著性差异，说明Trs85或Trs65和Trs85共同参与了饥饿处理后液泡的融合过程。　　 5.Bet3参与细胞自噬并部分通过小G蛋白Ypt1起作用通过在bet3ts菌株中整合GFP-Atg8、Atg9-3×GFP以及RFP-Ape1等自噬相关蛋白，研究了这些蛋白在营养丰富和营养缺乏条件下的运输情况，并结合Western blot技术，发现Bet3亚基参与了细胞的Cvt途径(Cytoplasm to Vacuole Targeting pathway)和巨自噬，其突变会导致RFP-Ape1在胞内形成一个亮的圆点，而GFP-Atg8无法向液泡运送等严重的自噬缺陷表型。进一步统计分析表明野生型和突变体间GFP-Atg8与RFP-Ape1的共定位率、Atg9-3×GFP与RFP-Ape1的共定位率以及Atg9-3×GFP点的亮度和直径，都有显著性差异。此外通过TAKA试验，表明Bet3突变影响了Atg9向PAS（Pre-autophagosomal structure/Phagophore assembly site）的顺向运输。这些结果说明，Bet3突变影响了Atg8的募集和Atg9的运输，从而导致细胞自噬无法进行。基于Bet3可能通过TRAPP复合体作用于Ypt小G蛋白Ypt1和Ypt31/32调控细胞自噬的可能性，本研究探讨了细胞自噬过程中Bet3与Ypt小G蛋白Ypt1和Ypt31之间的关系，结果表明，在营养丰富条件下，Ypt1和Ypt31单独过量表达或同时过量表达均无法抑制Bet3突变所导致的自噬功能缺陷;而在营养缺乏的条件下，Ypt1可部分抑制突变体中的自噬缺陷，且Ypt31可以促进Ypt1的抑制效果。　　 以上对TRAPP复合体不同类型的亚基参与囊泡运输和细胞自噬的研究结果，将为进一步分析这些亚基在囊泡运输与细胞自噬中的作用，解析这两大生理过程之间的联系提供理论依据。