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目的:1.诱导表达Zmp1,纯化获得Zmp1重组蛋白;用纯化到的重组蛋白Zmp1免疫新西兰大白兔,制备Zmp1多克隆抗体.2.用Zmp1蛋白定量作用雷帕霉素处理过的RAW264.7细胞,观察Zmp1蛋白对巨噬细胞RAW264.7自噬的影响。3.构建Zmp1真核表达载体,转染RAW264.7细胞,验证Zmp1的表达,雷帕霉素处理转染Zmp1的RAW264.7细胞,观察真核表达Zmp1对巨噬细胞RAW264.7自噬的影响。方法:1.将原核表达载体p ET32a(+)-zmp1转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Western blot鉴定其表达;用金属螯合磁珠纯化,超滤管浓集,获得纯化蛋白;用BCA蛋白定量试剂盒定量纯化蛋白。2.用纯化后的Zmp1重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备Zmp1多克隆抗体,用Western blot检测抗体的特异性和ELISA检测抗体效价。3.培养RAW264.7细胞,用不同浓度雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7,用同一浓度雷帕霉素诱导RAW264.7不同时长,Western blot检测自噬相关蛋白LC3的表达,观察雷帕霉素作用量和时间与诱导自噬强度的关系。选取雷帕霉素最适作用量和时间,诱导RAW264.7细胞,用不同剂量Zmp1蛋白作用巨噬细胞,透射电镜下观察自噬体形成的变化,Western blot检测自噬相关蛋白LC3表达,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测自噬相关基因Atg5,Atg8,Atg12的m RNA表达水平。4.设计引物,采用PCR从BCG基因组中克隆zmp1基因,将其连接到真核表达载体pEGFP-C1上,构建重组真核表达载体pEGFP-C1-zmp1,经酶切、测序鉴定重组载体构建成功后,用LipofectamineTM 3000 Reagent将质粒转染至RAW264.7中,在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况,实时荧光定量PCR检测转染细胞中zmp1基因m RNA的表达水平,Western blot检测Zmp1表达。5.雷帕霉素作用转染pEGFP-C1-zmp1后的RAW264.7细胞,透射电镜下观察自噬体形成的变化,Western blot检测自噬相关蛋白LC3表达,q RT-PCR检测自噬相关基因Atg5,Atg8,Atg12的m RNA表达水平。结果:1.SDS-PAGE显示,IPTG诱导出大小约为95 KD的蛋白,与Zmp1重组融合蛋白大小相符,Western blot结果在95 k D处可见阳性条带。经磁珠纯化和超滤管超滤浓集的重组融合蛋白,电泳后在95 k D处可见纯化且浓集的蛋白条带,测得重组蛋白含量为3.59 mg/m L。2.ELISA检测抗血清效价大于1∶102400,Western blot结果证实制备的多克隆抗体与Zmp1原重组蛋白特异结合。3.通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3的表达,100 ng/μL雷帕霉素作用RAW264.7细胞16 h后,LC3Ⅱ表达水平较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。透射电镜下观察自噬体形成,Zmp1蛋白作用组较雷帕霉素组自噬体数量明显减少;Western blot检测自噬相关蛋白LC3表达,Zmp1作用组较雷帕霉素组LC3Ⅱ表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),且随着Zmp1蛋白剂量增大,LC3Ⅱ表达水平有逐渐降低的趋势;RT-q PCR检测自噬相关基因Atg5,Atg8,Atg12的m RNA表达水平,Zmp1作用组较雷帕霉素组表达水平低,且差异有统计学意义(P<0.05)。4.PCR克隆出zmp1基因,重组真核表达质粒pEGFP-C1-zmp1酶切后,得到与理论值大小相符合的条带,DNA双向测序结果与Gen Bank中录注的序列相同。转染至RAW264.7后,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,RT-q PCR和Western blot鉴定重组真核表达载体pEGFP-C1-zmp1在RAW264.7细胞中能表达出Zmp1 m RNA和蛋白,Western blot结果在98 k D处可见阳性条带。5.将pEGFP-C1-zmp1转染至RAW264.7 24 h后,雷帕霉素诱导自噬,收集细胞,透射电镜下观察自噬体形成的变化,Zmp1质粒转染组较雷帕霉素组自噬体数量明显减少;Western blot检测自噬相关蛋白LC3表达,Zmp1质粒转染组较雷帕霉素组LC3Ⅱ表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);RT-q PCR检测自噬相关基因Atg5,Atg8,Atg12的m RNA表达水平,Zmp1作用组较雷帕霉素组表达水平低,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.成功表达纯化浓集Zmp1蛋白,免疫新西兰大白兔制备出Zmp1多克隆抗体。2.成功构建pEGFP-C1-zmp1真核表达载体,转染RAW264.7可表达Zmp1蛋白。3.巨噬细胞内和细胞外表达的Zmp1蛋白均可能抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7巨噬自噬过程。