肝癌(hetatocellular carcinoma,HCC)是一种恶性程度高、浸润和转移性强,治疗难度大的恶性肿瘤,至今仍无有效抗肝癌药物。人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是我国传统名贵中药,具有明显抗肿瘤效果,其主要活性成分为人参皂甙。最新药理学研究表明,人参发挥抗肿瘤作用的最终活性物质不是天然人参皂甙,而是其一系列肠道菌代谢产物。其中,人参皂甙肠道菌代谢物20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-20(S)-原人参二醇(简称IH-901,M1或Compound K)为天然二醇组人参皂甙肠道细菌最终代谢产物,是人参皂甙抗肿瘤作用的最终主要活性形式之一。然而,迄今为止,有关IH-901抗肿瘤的分子机制及其作用的分子靶点仍知之甚少。本论文首先采用植物化学方法,选用五加科人参属植物三七块根为原料,分离获得天然二醇组人参皂甙,然后参照人参皂甙肠内菌代谢机理,借助酶工程技术,首次分析比较了六种酶在体外酶法转化二醇组人参皂甙制备IH-901的效果,筛选最佳转化酶。结果表明,其中蜗牛酶转化能力最强,正交实验优化酶解反应,其最佳转化条件为:物料比为6/1、反应时间9h、反应温度为45℃、pH值为3.0,酶解得率达到54.24%。为进一步得到高纯度IH-901,采用硅胶柱层析技术进行分离纯化,纯化产物通过TLC、HPLC、UV、IR和NMR波谱进行结构和纯度鉴定。结果表明,纯化产物即为IH-901,其纯度大于98%。为研究IH-901抗肝癌的药效学功能效应,我们通过MTT法检测显示IH-901对三种普通肝癌细胞株SMMC7721、Bel7402、HepG2和一种高转移肝癌细胞株MHCC97-H均有明显的浓度和时间依赖的细胞增殖抑制效果。进一步通过细胞形态学观察,琼脂糖凝胶电泳DNA片段化分析,Hoechst 33258和AO/EB细胞核染色及流式细胞仪细胞周期分析等方法观察到IH-901能明显诱导肝癌SMMC7721和MHCC97-H细胞凋亡,且二者细胞周期均阻滞于G0/G1期。通过比较研究表明,IH-901对肝癌细胞株的体外细胞毒性和凋亡率均明显高于正常人肝癌细胞株Chang-liver。为了阐明IH-901诱导肝细胞SMMC7721凋亡的分子机制和药物作用靶点,我们首先研究了IH-901对线粒体凋亡信号通路的激活情况。研究显示,在IH-901的作用下,线粒体跨膜电位(△Ψm)明显下降,Cyt c从线粒体释放到细胞质中,同时发生了Caspase-3和Caspase-9的激活。Fas/FasL是另一种很重要的介导细胞凋亡的信号通路,我们发现IH-901也能上调FasL和Fas的表达。上述结果表明,IH-901能激活线粒体信号通路诱导SMMC7721凋亡,和Fas/FasL信号通路也密切相关,推测该二条信号通路在IH-901诱导的细胞凋亡中可能存在着相互交叉放大作用,共同执行着细胞凋亡信号转导通路的网络式调控。另外,通过对凋亡相关蛋白研究表明,IH-901能上调促凋亡蛋白Bax和P53蛋白的表达,而对抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-X_L没有影响。推测在凋亡网络通路中,下游Caspase活化的一个可能的机制是通过P53促进产生细胞周期阻滞,使细胞发生DNA修复或凋亡。P53是促凋亡蛋白Bax转录因子,P53表达的增加导致促凋亡蛋白Bax的表达,Bax通过调节线粒体膜的通透性,促进Cyt c的释放,从而促进细胞的凋亡进程。为进一步探讨IH-901对肝癌细胞侵袭转移及血管生成的抑制效果及其作用的分子靶点。首先,体外研究表明,IH-901能有效的抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖,使其细胞周期阻滞在G0/G1期,诱导其凋亡。进一步研究发现,IH-901对ECV304的黏附和迁移能力也有明显的抑制作用。其次,通过一系列细胞侵袭转移的细胞学实验表明,IH-901体外可明显抑制肝癌高转移MHCC97-H细胞的黏附、迁移和侵袭。在分子水平上,IH-901可抑制肝癌细胞MMP-9和VEGF的表达。进一步裸鼠体内实验,IH-901能明显抑制高转移肝癌MHCC97-H细胞向肝和肺部转移,免疫组化染色显示IH-901能抑制MMP-9和VEGF在裸鼠荷肝癌组织中的表达,且与MVD密切相关。以上结果表明,IH-901不仅具有抑制肝癌细胞侵袭转移的功能,而且在抑制血管形成方面发挥重要作用,MMP-9和VEGF为其重要作用分子靶点。