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慢性淋巴细胞白血病是一种单克隆B淋巴细胞在外周血、骨髓和外周淋巴组织或器官中聚集的疾病。NF-κB是一种具有多向性转录调节作用的蛋白质因子家族。研究发现,CLL细胞中NF-κB活性可呈一定程度的增强,NF-κB表达和活性的变化与CLL细胞的生存率之间存在密切的联系,但CLL中NF-κB活化的具体机制至今尚不清楚。本研究选择由苏州大学附属第一医院血液科明确诊断的CLL患者的骨髓标本作为研究对象,对NF-κB家族成员mRNA表达水平进行分析,发现骨髓来源CLL细胞中NF-κB家族各成员在CLL细胞中存在不同程度的表达。NF-κB的DNA结合活性分析发现,CLL患者骨髓细胞中NF-κB活性具有异质性。定量分析显示,CLL患者骨髓B细胞的平均RelA活性明显高于正常人B细胞。CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞的RelB活性无显著性差异。RelB活性在不同CLL患者中差异显著。RelB在CLL-B细胞中确实存在,但只在部分CLL-B细胞中升高。对不同NF-κB活性的CLL患者进行临床特征性分析,发现RelA高表达、RelB低表达的患者,常处于疾病早期,且IgHV为突变状态,提示预后较好。将CLL-B细胞在有骨髓基质细胞和无基质细胞两种条件下进行培养,通过流式细胞术对不同NF-κB活性的CLL-B细胞死亡率进行分析,结果发现,无论有无骨髓基质细胞存在,RelA+/RelB+组生存率均高于RelA+/RelB-组。RelB活性增强,同时有RelA活性,标志着骨髓中CLL-B细胞的生存优势。CLL-骨髓基质细胞共培养诱导CLL-B细胞RelA和RelB的表达。通过探讨RelB活性与CLL患者对氟达拉滨和蛋白酶体抑制剂（PS-341,MG-132）的敏感性的关系,发现CLL-B细胞对氟达拉滨的敏感性与RelB活性无关。RelB的活化使CLL-B细胞对蛋白酶体抑制剂的反应性增强。与MG-132相比,PS-341诱导CLL-B细胞的死亡率更高。NOTCH1和MYD88基因突变介导NF-κB活化,与CLL化疗耐药和不良预后相关。在本研究中,我们建立了一个准确而灵敏的HRM法,检测出6.02%（8/133）的CLL患者存在NOTCH1的PEST区域的基因突变,而8例突变患者中有7例的熔解曲线完全相同,经直接测序法证实为c.75417542delCT（p.P2514fs*4）突变,1名患者的熔解曲线与前7例也存在不同,经直接测序法被确认为c.75357536 insC（p.2513fs*3）突变。4.65%（6/129）的CLL患者具有与野生型完全不同的熔解曲线,经直接测序法证实存在MYD88 p.L265P突变。所有CLL标本均经过直接测序法进一步验证,结果发现,HRM结果与直接测序法完全一致,准确性达到100%。通过分析HRM法和直接测序法的敏感性进行比较,发现直接测序法和HRM法的敏感性分别为10%和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。我们建立的NF-κB通路相关分子NOTCH1和MYD88基因的HRM突变检测方法有效、快速、敏感,与直接测序法相比,它具有更高的敏感度、更短的检测时间,非常适用于常规进行CLL患者基因突变的高通量筛查,有助于患者个体化临床治疗策略的制定和确认。第一部分经典性和非经典性NF-κB活性在慢性淋巴细胞白血病中的作用目的:分析CLL中经典和非经典性NF-κB信号通路的活性和表达。方法:1,采用qRT-PCR法检测CLL患者骨髓中B细胞的NF-κB家族成员的mRNA表达水平,并与正常人骨髓来源的B细胞进行比较。2,通过凝胶迁移实验和NF-κB DNA结合实验对CLL细胞中NF-κB的DNA结合活性分别进行定性和定量分析。3,对不同NF-κB活性的CLL患者进行临床特征性分析。结果:1,NF-κB家族各成员在CLL细胞中存在不同程度的表达。所有CLL患者的B细胞中均存在RelA mRNA的表达。p50、RelB和p52的mRNA表达在CLL患者中存在差异,部分患者未测出。2,凝胶迁移实验发现部分CLL患者骨髓细胞中CD19+CD5+细胞核蛋白检测到很强的κB-DNA结合活性;部分患者κB-DNA结合活性弱,还有一些几乎检测不到κB-DNA结合活性。NF-κB DNA结合实验定量结果显示,CLL患者骨髓细胞平均RelA活性明显高于正常人的B细胞。CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞RelB活性无显著性差异。RelB活性在不同CLL患者中差异显著。RelB在CLL-B细胞中确实存在,但只在部分CLL-B细胞中升高。3,不同NF-κB活性的CLL患者临床特征分析发现,RelA高表达、RelB低表达的患者,常处于病程早期并伴有IgHV突变状态,提示预后较好。RelB活性与细胞的遗传学改变、ZAP-70和CD38的表达,NOTCH1基因突变与否无相关性。结论:CLL患者骨髓B细胞中均有RelA mRNA的表达,部分的CLL-B细胞中有RelB mRNA的表达。不同CLL-B细胞中RelA mRNA和RelB mRNA表达水平不同;CLL患者骨髓细胞平均RelA活性明显高于正常人的B细胞,CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞RelB活性无显著性差异,RelB活性在不同CLL患者中差异显著;RelA高表达,RelB低表达的患者与IgHV突变呈正相关,预后较好。第二部分非经典途径NF-κB分子活性影响CLL细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性目的:研究不同NF-κB信号通路活性对CLL细胞体外存活的影响以及对蛋白酶体抑制剂的敏感性。方法:1,将CLL-B细胞在有骨髓基质细胞和无基质细胞两种条件下进行培养,采用流式细胞术在0、24、48和72 h分别检测CLL细胞死亡率。2,采用Western blot法检测共培养后CLL-B细胞中RelA和RelB的表达。3,CLL-B细胞分别与氟达拉滨以及蛋白酶体抑制剂MG-132和PS-341共同孵育,共培养0、24、48和72 h,采用流式细胞术检测CLL细胞的死亡率。结果:1,无骨髓基质细胞参与情况下:RelA+/RelB-组骨髓中的CLL-B细胞比RelA+/RelB+组中的细胞早24 h开始死亡。存在骨髓基质细胞进行培养情况下,RelA+/RelB-组死亡率均高于RelA+/RelB+组,差异有显著性。无论有无骨髓基质细胞存在,RelA+/RelB+组生存率高于RelA+/RelB-组。2,骨髓基质细胞与CLL-B细胞相互作用,诱导RelA+/RelB-组骨髓CLL-B细胞中RelA和RelB的表达,并呈时间依赖性。在RelA+/RelB+组,骨髓基质细胞与CLL-B细胞相互作用,RelB在细胞浆中的表达降低,但RelB在细胞核中的表达显著增强。3,在RelA+/RelB+和RelA+/RelB-组间,不管是否存在骨髓基质细胞,使用氟达拉滨治疗下,两者细胞的死亡率差异无统计学差异（P>0.05）。4,加入1μM MG-132后,与骨髓基质细胞共培养24h和48 h时,RelA+/RelB+组的细胞死亡率高于氟达拉滨,差异有显著性（P<0.05）;而RelA+/RelB-组无此情况（P>0.05）;骨髓基质细胞对 RelA+/RelB+和 RelA+/RelB-组 B细胞在MG-132治疗中起到保护作用。无论骨髓细胞存在与否的条件下,RelA+/RelB-组的CLL-B细胞对MG-132的敏感度均偏低。5,在有骨髓基质细胞或无骨髓基质细胞共培养情况下,PS-341处理后,各时间点CLL-B细胞的死亡率明显高于氟达拉滨和 MG-132（P<0.05）。培养 24 h 和 48 h 后,在 RelA+/RelB+组,PS-341 诱导细胞死亡率高于RelA+/RelB-组（P<0.05）,且与骨髓基质细胞存在与否无关,骨髓基质细胞对PS-341治疗下细胞的保护仅发生在24 h。结论:1,RelB活性增强,同时有RelA活性,标志着骨髓中CLL-B细胞的生存优势。2,CLL-骨髓基质细胞共培养,诱导CLL-B细胞的RelA和RelB表达,这是骨髓基质细胞发挥保护作用的原因。3,骨髓中CLL-B细胞对氟达拉滨的敏感性与RelB无关。RelB的活化使CLL-B细胞对蛋白酶体抑制剂的反应性增强。与MG-132相比,PS-341诱导CLL-B细胞的死亡率更高。第三部分与NF-κB活性相关分子NOTCH1基因突变的HRM检测方法的建立及其意义目的:建立筛查NOTCH1突变的HRM方法并探讨NOTCH1突变在CLL中突变的意义。方法:采集133例CLL患者骨髓,提取CLL-B细胞gDNA。同时培养急性淋巴细胞白血病细胞Molt 4细胞和急性T细胞白血病细胞系Jurkat细胞,作为NOCH1突变的阳性和阴性对照,建立HRM法筛查CLL患者中NOTCH1的突变情况,并与直接测序法进行比较,并对HRM法进行敏感性和准确性的评估。结果:在133例初诊为CLL的患者中,6.02%（8/133）的患者与其余125例其他患者的熔解曲线有明显差异。其中7位患者的熔解曲线一致,经直接测序法确认为c.75417542delCT（p.P2514fs*4）突变。1名患者的突变完全不同,经直接测序法被确认为c.75357536 insC（p.2513fs*3）突变。HRM分析检测到的突变的结果与直接测序的结果是完全一致的,准确性达到100%,直接测序法和HRM法的敏感性分别为10和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。结论:HRM法通过产生的不同熔解曲线来分辨CLL患者NOTCH1野生型和突变型的标本,结果经直接测序法证实为可靠,且灵敏度较高,可以作为临床筛查慢性淋巴细胞白血病NOTCH1基因突变的常规检查方法。第四部分与NF-κB活性相关分子MYD88基因突变的HRM检测方法的建立及其意义目的:建立筛查MYD88突变的HRM方法并探讨MYD88突变在CLL中突变的意义。方法:采集129例CLL患者骨髓,提取CLL-B细胞gDNA,采用TA克隆法制备MYD88野生型质粒,采用定点突变法制备MYD88突变型质粒,分别作为阴性和阳性对照,建立HRM法筛查CLL患者中最常见的MYD88 p.L265P的突变,并与直接测序法进行比较,并对HRM法进行敏感性和准确性的评估。结果:通过HRM法,发现129例标本中有6例出现MYD88 p.L265P突变,突变率4.65%。结果与直接测序法完全一致,准确性达到100%。直接测序和HRM的敏感性分别为10和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。结论:HRM与直接测序法比较,有较高的敏感度,操作简便,耗时少。HRM法可以作为临床筛查CLL中MYD88 p.L265P突变的常规检查方法。