研究背景：在全世界范围内,结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的病死率居所有恶性肿瘤的第三位,总发病率约占5%,5年生存率约为40%-60%。尽管CRC的治疗在过去数十年中取得了长足进步,但患者总生存期并未明显延长。超过1/3的CRC最终将发生远处转移,这将导致患者的不良预后和低生存率。由于CRC侵袭转移的分子机制复杂,因此,参与此过程新分子的发现对于CRC的靶向治疗将至关重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约17到25个核苷酸的非编码小RNA分子(non-coding RNA,ncRNA),通过与靶信使核糖核酸(mRNA)3’端非编码区(3’-UTR)特异结合,抑制转录后翻译而下调基因表达。MiRNA的调节异常在人体许多生理生化过程中起着决定性的作用,如细胞增殖、分化、细胞凋亡、恶变和转移等。近来研究发现,miR-149在多种恶性肿瘤中呈低表达,并在非小细胞肺癌、恶性胶质瘤、胃癌中起着抑癌基因的作用。目前miR-149和CRC的相关性已被多个研究报道：Wang等发现,在CRC中SP1可调节抑癌基因miR-149甲基化和表达之间的联系；Vinci等探讨了miR-146a、miR-196a、miR-499和miR-149在CRC中序列变化的分布规律及对miRNA表达的影响；Du等发现,miR-149和miR-196a2的多态性可能提高CRC的发病风险。这些研究均表明,miR-149的调节异常将对CRC的发生发展起着重要作用。叉头框蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1)属于叉头框蛋白家族,是一个典型的增殖特异性转录因子。该家族成员均具有一个高度保守脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)结合域,称为“叉头框”或“翼状螺旋结构”。FOXM1在调节有丝分裂Gl-S、G2-M和纺锤体稳定中起着重要作用,其高表达可能导致细胞恶变和肿瘤进展。在多种恶性肿瘤中,均发现FOXM1及其家族其他成员的高表达状态,并且FOXM1的高表达状态与肿瘤的血管生成、侵袭和转移过程密切相关。在既往研究中,我们已证实FOXM1高表达可作为CRC侵袭转移潜能和不良预后的预测分子指标,然而其相关的分子机制尚未明确。目前有研究发现,miR-149可通过调控FOXM1表达抑制非小细胞肺癌细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitiong, EMT),但其在CRC细胞侵袭转移中的作用尚未明确。本研究利用实时定量RT-PCR、Western blot、生物信息学和荧光素酶活性实验等方法,分析miR-149在CRC组织和细胞中的表达水平及其临床病理和预后价值,探寻miR-149对CRC细胞中FOXM1基因表达的调控作用,并通过体外实验探索其在CRC细胞迁移和侵袭过程中的功能和分子机制。目的：探讨miR-149表达在CRC中的临床病理意义和预后价值,以及miR-149/FOXM1在CRC细胞迁移和侵袭过程中的功能和机制,为进一步阐明和完善CRC中miR-149表达紊乱及其功能异常的分子调控机制,寻找CRC新的治疗靶点提供实验依据。方法和结果：第一章MiR-149在CRC中的表达及其临床意义方法：1.在收集的CRC组织、癌旁组织、正常结肠组织、一系列转移能力不同的CRC细胞(HCT116、LoVo、SW480)和正常结肠细胞(NCM460)中,利用实时定量RT-PCR检测miR-149的表达水平。2.结合临床信息分析全部78例CRC组织中miR-149表达水平与临床病理特征和预后的关系。3.在收集的CRC组织、癌旁组织和正常结肠组织中,运用实时定量RT-PCR检测FOXM1的表达水平,并分析其与miR-149表达水平之间的关系。结果：1.CRC组织(n=78)中miR-149的表达水平显著低于正常结肠组织(n=20)(P<0.01)；与对应癌旁组织(n=20)相比,CRC组织(n=20)中miR-149的表达水平显著降低(P<0.01)；同时,与无淋巴结或远处转移的CRC组织(nmCRC,n=38)相比,有转移的CRC组织中(mCRC,n=40) miR-149表达水平显著降低(P<0.01)。此外,正常结肠细胞株NCM460的miR-149表达水平最高,低转移性CRC细胞株LoVo和SW480次之,高转移性CRC细胞株HCT116中,miR-149表达水平最低(P<0.01)。2.相关性分析发现,CRC组织中miR-149的表达水平与患者淋巴结转移(P=0.024)、远处转移(P=0.045)、TNM分期(P=0.033)呈显著相关；Kaplan-Meier生存曲线和Cox风险比例回归模型分析发现,miR-149低表达预示总生存期缩短(P<0.01),可作为判断CRC患者预后的独立危险因素(P=0.011; HR=2.658; 95% CI:1.308-3.087)。3.CRC组织(n=78)中FOXM1的mRNA表达水平显著高于正常结肠组织(n=20)(P<0.01)；20对CRC和癌旁组织对比中,癌组织中FOXM1 mRNA表达水平显著增高(P<0.01)；同时,有淋巴结或远处转移的CRC组织(mCRC,n=40)中FOXM1 mRNA表达水平显著高于无转移的CRC组织(nmCRC,n=38)(P<0.01)。此外,FOXM1的表达水平和miR-149表达水平呈负相关(r=-0.553,P<0.01)。第二章MiR-149对CRC细胞和正常结肠细胞生物学特性的影响方法：1.通过合成miR-149 mimics和inhibitor并瞬时转染CRC细胞(HCT116、LoVo)和正常结肠细胞(NCM460),人为改变细胞内miR-149表达水平,运用MTT实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。结果：1.与对照组miR-NC mimics相比,转染miR-149 mimics的HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著下降(P<0.01)。相反,在LoVo细胞中人为下调miR-149表达水平,可增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。2.下调正常结肠细胞NCM460中miR-149表达水平,可增强细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。第三章MiR-149靶向调控CRC细胞FOXM1基因的表达方法：1.运用三个不同的miRNA/靶基因在线分析软件TargetScan (http://www.targetscan.org/)、PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/)和miRNA targets (http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/),分析FOXM1 mRNA 3’-UTR序列中潜在的miRNA结合位点,将预测结果作交集分析。2.将miR-149 mimics、inhibitor及其对照分别与含FOXM1-3’-UTR-wt和FOXM1-3’-UTR-mut序列的荧光素酶质粒载体瞬时共转染HCT116细胞,运用荧光素酶活性实验,根据荧光素酶活性变化鉴定miR-149是否能与FOXM13’-UTR序列结合。3.运用实时定量RT-PCR和Western blot验证miR-149对FOXM1的调控作用。结果：1.通过生物信息学软件和交集分析发现,FOXM1 mRNA 3’-UTR序列上存在miR-149的潜在结合位点。2.荧光素酶活性实验发现,miR-149能与FOXM1 mRNA3’-UTR序列结合,使荧光强度显著下降。3.MiR-149能直接靶向调控FOXM1基因的表达。第四章MiR-149调控CRC细胞侵袭转移的机制研究方法：1.构建FOXM1干扰质粒(pSil/shFOXM1)并稳定转染HCT116和LoVo细胞,人为下调细胞内FOXM1的表达水平,采用MTT实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验检测各组细胞增殖、迁移和侵袭能力的差异。2.构建FOXM1基因真核表达载体(pEGFP/FOXM1)与空质粒对照(pEGFP/control)分别转染HCT116/miR-149 mimics细胞,实时定量RT-PCR和western blot技术检钡FOXM1 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验分析各组细胞增殖、迁移和侵袭能力的差异。3.运用实时定量RT-PCR和Western blot技术分别检测HCT116/miR-149 mimics、 HCT116/shFOXMl及其对照细胞中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR mRNA和蛋白的表达水平。FOXM1基因真核表达载体(pEGFP/FOXM1)与空质粒对照(pEGFP/control)分别转染HCT116/miR-149 mimics细胞,实时定量RT-PCR和Western blot技术检测MMP-2、MMP-9、VEGF-A和PAR mRNA和蛋白的表达水平。4.实时定量RT-PCR检测miR-149高表达组(n=33)和miR-149低表达组(n=-45)CRC组织中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表达水平。结果：1.HCT116/shFOXM1和LoVo/shFOXM1细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著下降。提示阻断FOXM1的表达可模拟miR-149对CRC细胞的生物学效应。2. FOXM1表达恢复可部分逆转miR-149过表达所介导的对CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。提示miR-149对CRC细胞生物学特性的作用部分是由FOXM1介导的,FOXM1是miR-149重要的功能性靶基因。3.上调miR-149或下调FOXM1均能抑制CRC细胞MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的表达。恢复FOXM1表达能逆转miR-149过表达对CRC细胞MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR表达的抑制作用。4.MiR-149低表达组(n=45)CRC组织中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表达水平均高于miR-149高表达组(n=33)。结论和意义：1.MiR-149在CRC组织尤其是有淋巴结或远处转移的组织中低表达,FOXM1在CRC组织中高表达,两者呈负相关。MiR-149的表达水平与CRC患者淋巴结转移、远处转移、TNM分期以及临床预后相关。2.MiR-149可抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3.MiR-149能与FOXM1 mRNA 3’-UTR直接结合并调控FOXM1基因的表达。4.MiR-149对CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用部分是由FOXM1介导的,并与MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR密切相关。提示FOXM1是miR-149重要的功能性靶基因,MMP-2、MMP-9. VEGF-A和uPAR可能是miR-149/FOXM1影响CRC细胞迁移和侵袭的重要效应分子。5.本研究首次分析了miR-149在CRC中的表达异常及其与临床病理特征和预后的关系,发现了miR-149对CRC细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响,并探讨了miR-149在CRC细胞中发挥作用的分子机制。提示miR-149/FOXM1通路可能成为CRC治疗的新型分子靶点。