论文部分内容阅读
碱性神经酰胺酶2(Alkaline ceramidase 2,ACER2)是一个定位于高尔基体膜上的七次跨膜蛋白,在除了胎盘的各种正常组织中广泛低表达,应对细胞刺激如DNA损伤、血清饥饿时表达明显上调。ACER2参与鞘磷脂的代谢,能催化神经酰胺水解生成鞘氨醇,鞘氨醇进一步磷酸化生成1磷酸鞘氨醇。ACER2可以通过控制神经酰胺、鞘氨醇及1磷酸鞘氨醇的相对水平进而在细胞的增殖、衰老、凋亡等过程中发挥作用以控制细胞的命运。我们课题组前期的研究工作已经鉴定了ACER2的转录起始位点并确定了ACER2基因的启动子。转录因子结合位点分析结果显示,ACER2基因的启动子含有Sp1、GATA-1和AP-1等潜在的转录因子结合位点。本研究在这一基础上,进一步对ACER2启动子区域重要的顺式作用元件进行分析,并进一步重点研究ACER2在细胞的自噬与凋亡中作用以及发挥功能的机制。(1)ACER2启动子区域重要转录因子结合位点的进一步分析采用UCSC基因组浏览器分析ACER2的基因组结构及基因组成,根据ENCODE组蛋白修饰数据及Chrom HMM染色体状态分割数据发现ACER2基因是活跃转录的。采用Mat Inspector专业版与TFSEARCH软件对ACER2的启动子区进行转录因子结合位点分析,发现有两个潜在的p53结合位点。这两个潜在的p53结合位点序列在人、大鼠和小鼠中具有一定的保守性,提示其在ACER2启动子的转录调控中起重要作用。(2)p53直接调节ACER2启动子的转录首先,将前期构建的各ACER2启动子报告基因系列删除体、后期构建的ACER2-P397启动子p53结合位点定点突变重组体以及p21、Bax的报告基因分别单独转染或与p53真核表达质粒共转染入H1299细胞,结果提示,p53过表达能够显著提高p21、Bax的报告基因的活性以及ACER2-P397、ACER2-P676、ACER2-P800及ACER2-P1285删除体的活性,但p53过表达对第一个p53结合位点的定点突变重组体的启动子活性的上调作用受到显著削弱甚至丧失,提示p53主要通过ACER2启动子区域中的第一个潜在的p53结合位点发挥对ACER2直接转录激活作用。同时,将p53过表达质粒转染入H1299细胞,定量QRT-PCR结果显示,p53的过表达可导致细胞内源性的ACER2的m RNA水平升高。采用ADR处理H1299与A549细胞,定量QRT-PCR结果显示,DNA损伤可使p53野生型的A549细胞内源性的ACER2的m RNA水平升高。然后将p53 si RNA转染入A549细胞,再联合ADR处理,定量QRT-PCR结果的显示,si RNA介导的p53表达抑制可导致细胞内源性的ACER2 m RNA水平降低。另外,染色质免疫沉淀分析(Ch IP)结果也证实,p53可以在体内结合在ACER2启动子核心区域的第一个潜在的p53结合位点。这些结果提示,p53可以直接调节ACER2启动子的转录,ACER2是一个新的p53靶基因。(3)ACER2诱发自噬与凋亡首先,将前期构建的ACER2真核表达质粒及p53表达质粒单独及联合转染入H1299细胞,wetern blot的结果分析表明,ACER2过表达能够上调LC3-II的表达,且与p53联合共转能诱发更强的LC3-II的上调;透射电镜的分析结果表明,ACER2过表达能够诱发自噬小体的增多,且与p53联合共转能诱发更多的自噬小体;免疫荧光及转染GFP-LC3质粒的实验结果分析表明,ACER2过表达能够诱发LC3-II斑点的增多,且与p53联合共转能诱发更多的LC3-II斑点;流式细胞术的实验结果表明,ACER2过表达后H1299细胞的凋亡数量增多,且与p53联合共转有助于p53诱发更多的细胞凋亡。我们将ACER2表达质粒转染入A549细胞并联合阿霉素(ADR)刺激,western blot与流式细胞术的实验结果表明,ACER2有助于DNA损伤诱发的细胞自噬与凋亡。然后我们将ACER2 si RNA及自噬的关键基因ATG5 si RNA转染入A549细胞,再联合ADR处理,western blot与流式细胞术的实验结果表明,DNA损伤诱发的自噬与凋亡需要ACER2基因。我们采用定点突变的方法构建ACER2蛋白N末端13、36个氨基酸残基分别缺失的删除体,将这两个删除体转染入H1299细胞中,western blot的结果分析表明,删除N末端13、36个氨基酸残基后也能诱发自噬。这些结果提示,ACER2能诱发自噬与凋亡,且有助于p53及DNA损伤诱发的自噬与凋亡。(4)ACER2通过产生ROS诱发自噬与凋亡我们采用NAC处理细胞后再将ACER2表达质粒转染入H1299细胞,流式细胞术的结果表明,NAC能够清除ACER2过表达产生的ROS;紧接着我们采用western blot及流式细胞术分别检测自噬与凋亡,发现使用NAC处理后ACER2诱发的自噬与凋亡明显减弱。然后我们将ACER2的表达质粒转染入H1299再联合H2O2处理,western blot及流式细胞术的结果分析表明,ACER2有助于H2O2诱发的自噬与凋亡。这些结果提示,ACER2通过产生ROS诱发自噬与凋亡。综上,我们的研究不仅发现ACER2启动子区域含有“明星基因”p53等重要的转录因子结合位点,而且进一步明确p53可以直接激活ACER2启动子的转录,并且可以调控内源性ACER2的表达。转录激活的ACER2能够诱发自噬与凋亡,且有助于p53及DNA损伤诱发的自噬与凋亡。DNA损伤诱发的自噬与凋亡需要ACER2基因的参与。明确了ACER2是通过鞘氨醇的积累产生更多ROS的机制诱发自噬与凋亡。本研究为进一步深入研究ACER2在细胞自噬与凋亡等过程的调控及肿瘤发生发展的调控机制和分子行为机制奠定一定的基础,对于丰富p53在鞘磷脂的代谢调控理论以及分子肿瘤学理论也均具有重要科学意义。