造成胃癌治疗预后不良的两个主要的因素是转移(包括微转移)与耐药。本课题的研究目标是识别胃癌微转移、耐药的预测标志及可重复的多维组学特征。1.识别微转移与术后复发风险预测标志与胃癌转移相关的多维组学特征早期胃癌术后复发率很高,除了手术失败及几率较低的肿瘤重新发生的因素之外,临床影像及病理检测难以发现的微转移是术后复发的主要原因。因此,亟需发展预测胃癌微转移与术后复发风险的标志。另外,由于按TNM分期标识的转移与无转移临床样本存在较高的转移假阴性和假阳性率,在两类样本间难以识别独立可重复的差异表达基因。因此,我们做了如下两方面的研究。(1)识别微转移与术后复发风险预测标志:首先,利用77例仅接受手术治疗的早期胃癌患者的基因表达谱,识别了一个由COL8A1、PTPRE和NALCN等37个基因组成的19对基因标志(19 gene pair signature,19-GPS),根据每对基因在样本内的表达水平的相对高低秩序关系,通过多数投票规则预测早期胃癌微转移与术后复发风险。在两组分别包含71和46例样本的独立数据中,验证了该标志。(2)识别可重复的转移相关的多维组学特征:利用19-GPS排除可能的转移假阴性(复发高风险的N0M0样本)与假阳性样本(复发低风险的N+或M1样本)后,识别了数千个在以上三组数据中高度可重复的在转移与非转移组间差异表达的基因(limma,FDR<5%)。只利用TNM分期,则找不到可重复的转移相关基因。根据The cancer Genome Atlas(TCGA)网站提供的胃癌多维组学数据,联合19-GPS与TNM分期重新认定转移状态后,发现SERPING1、THBS4和PODN等599个基因的启动子区域的Cp G位点在转移组中出现了DNA低甲基化(Wilcoxon秩和检验,FDR<5%)及m RNA高表达。这些基因显著富集于c AMP和PI3K-Akt等转移相关的通路。但是,未发现转移组与无转移组间的基因拷贝数变异和基因突变的差异(Fisher精确检验,FDR<5%)。2.识别5-FU耐药预测标志及胃癌耐药相关的多维组学特征对中晚期胃癌,基于5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)的化疗是一线治疗方案,但其整体响应率只有20%-40%。同时,胃癌耐药相关基因的识别也存在信号弱、难以独立验证的问题。因此,我们做了如下两方面的研究。(1)识别稳健的5-FU耐药预测标志:首先,利用27种5-FU敏感-耐药的胃癌细胞系和35例接受基于5-FU化疗患者的胃癌组织基因表达谱,我们识别了一个由两对基因(KNCE2和API5;KCNE2和PRPF3)构成的5-FU耐药预测标志。利用一组包含123例样本的独立数据,我们验证了该耐药预测标志可以识别出不能获益于5-FU的胃癌患者。(2)识别耐药相关的多维组学特征:利用耐药预测标志将TCGA等三组独立数据重新分组后,在每组数据中都识别了数千个在耐药与敏感组间差异表达的基因(limma,FDR<20%),且在三组数据集间具有高度的可重复性。根据TCGA的多维组学数据,发现327个基因的启动子区域的Cp G位点在耐药组中出现了DNA高甲基化(Wilcoxon秩和检验,FDR<20%)及m RNA低表达,其中PDE1、CENTPD3和CBS等19个基因参与嘧啶和叶酸代谢功能,提示其DNA高甲基化与胃癌的5-FU耐药相关。同时,7个拷贝数区域在耐药组中有显著高的扩增频率(Fisher精确检验,FDR<20%),其中PMS2、HMGB1和RFC3等11个基因参与DNA修复、细胞周期和凋亡功能。在敏感样本中,突变基因的平均数为366.69,显著高于在耐药样本中突变基因的平均数305.32(Wilcoxon秩和检验,p=3.75E-02),提示基因组不稳定的胃癌患者对基于5-FU的化疗敏感。3.分析肿瘤细胞系模型表达谱的新策略利用癌细胞系模型分析敲除、转染目标基因或药物处理后的基因表达与通路异常,是验证肿瘤转移、耐药特征基因功能的常用方法,但是通常只设置2或3个对照样本。此时,常用的差异表达基因识别算法缺乏统计效能或有很高的假阳性率。为此,我们提出了基于基因表达秩序关系识别差异基因的新方法,并通过仿真和实测数据,证实了该方法可以在小样本细胞系表达谱数据中准确地识别差异基因。总之,本研究识别了胃癌微转移与术后复发风险预测标志及5-FU耐药的预测标志,并利用这两种预测标志辅助识别了胃癌转移和耐药相关的可重复的多维组学特征。我们也发展了小样本肿瘤癌细胞系表达谱分析的新方法,为后续利用细胞系模型验证胃癌转移、耐药相关标志基因的功能奠定了基础。