本文分析了长期饮酒对C57背景HBV--Tg小鼠肝脏损伤作用。本研究分为两个部分：　　 第一部分：长期饮酒对C57背景HBV-Tg小鼠肝脏损伤作用的观察。　　 背景：全球每年大约有60万的患者死于肝硬化、肝癌等相关疾病，是全世界排位第七的致死因素。其中我国是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染的高发区，乙肝的发病率和患病率均居世界的首位。近年来随着酒精摄入量的增加，我国酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)的发病率呈逐年上升趋势，但长期大量饮酒者并不都罹患ALD，其发生还与是否伴存肝炎病毒感染、营养状况及遗传等因素相关。相关研究显示ALD患者中合并乙肝病毒感染率较高，其乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HbsAg)携带率远高于正常人群。综合上述研究可发现，在肝病患者中，饮酒和HBV感染对肝脏损伤有协同作用。本实验室一直致力于研究酒精联合HBV感染对小鼠肝细胞作用的影响及其机制，在HBV-Tg小鼠(HBV transgenic mice)肝细胞以及同遗传背景的小鼠肝细胞对外源施加氧化损伤因素酒精敏感性差异的实验中，证实HBV-Tg小鼠肝细胞更易受损伤。2010年由黄娟娟等人进行的相关研究发现，经过酒精灌胃处理2个月后，HBV-Tg小鼠相对于野生型小鼠有明显的肝纤维化趋势，肝纤维化指标明显升高，但组织学并未出现肝纤维化。肝纤维化严重威胁着人类的健康，是各种慢性肝病重要的病理基础。目前临床研究发现，饮酒与HBV感染在肝纤维化的发生及进展中对肝脏损害有协同作用，过度饮酒与HBV感染使肝功能损伤程度加重，使肝纤维化和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的发生率增高。因此，建立合适的肝纤维化动物模型对于肝纤维化机制的研究有重要的意义。我们的实验通过用酒精直接干预HBV转基因小鼠的体内实验，观察两因素间的相互作用，来证实和补充之前的体外实验研究结果及不足，深入研究长期慢性饮酒对肝脏的损伤作用，以期在HBV-Tg小鼠中观察到肝纤维化的形成，以利于酒精及HBV相关性肝病的防治，探索相关疾病模型。　　 目的：HBV-Tg小鼠随着生存时间的延长，是否存在自发的肝纤维化、癌变趋势;酒精作为肝细胞损伤因子作用于HBV-Tg和野生型小鼠，是否可以诱导肝纤维化或癌变，探索HBV相关疾病动物模型。　　 方法：适应性喂养1周后，酒精组小鼠前2周给予含酒精体积分数为0.01的饮用水自由饮取，以后每1周提高0.01，当达0.05时，加入浓度为0.5 g·L-1蔗糖溶液，连续观察4周，之后每2周增加0.01体积分数的酒精直至0.2，维持此浓度，至实验结束;对照组自由饮水。期间关注小鼠活动状态，每3个月称重、采血1次，并处死1只小鼠，观察肝组织病理学变化。实验结束后，检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、HBsAg、肝组织转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)、血小板衍生长因子(platelet-derivedgrowth factor，PDGF-BB)及羟脯氨酸((hydroxyproline，HYP)水平。行肝组织苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色、天狼星红苦昧酸染色以观察肝脏形态学改变及胶原沉积情况，同时行肝组织乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis Bcore antigen，HBcAg)、HBsAg免疫组化检测HBcAg、HBsAg的表达，泛素(Ubiquitin)免疫组化观察酒精透明小体（Mallory小体）情况。　　 结果：⑴HBV-Tg酒精组小鼠HBsAg水平在第6个月时最高，第9月时显著高于HBV-Tg对照组(P＜0.05)，第15个月时HBsAg水平呈下降趋势，第18个月时显著低于HBV-Tg对照组(P＜0.05)。HBV-Tg酒精组小鼠血清ALT、肝组织TGF-β1、PDGF-BB及HYP水平显著高于野生型对照组、HBV-Tg对照组、野生型酒精组（P＜0.05）。⑵肝组织HE染色HBV-Tg酒精组小鼠肝细胞明显脂肪变、坏死，胞核增生，胞浆内见颗粒状或不规则形的Mallory小体，野生型酒精组小鼠肝脏中可见Mallory小体及脂肪空泡，其肝损伤程度较HBV-Tg酒精组小鼠轻。HBV-Tg对照组肝细胞索排列紊乱，肝细胞边缘不清楚，轻度脂肪变，野生型对照组小鼠肝组织基本正常。⑶肝组织天狼星红苦味酸染色HBV-Tg酒精组小鼠肝纤维化程度最严重，汇管区明显胶原纤维增生，并向周围肝小叶内延伸。野生型酒精组、HBV-Tg对照组及野生型对照组小鼠仅汇管区见少量胶原纤维沉积。⑷小鼠肝组织HBcAg、HBsAg、泛素免疫组化 HBV-Tg酒精组小鼠肝组织HBcAg、HBsAg水平显著高于HBV-Tg对照组(P＜0.05)。仅野生型酒精组和HBV-Tg酒精组中有Mallory小体，且HBV-Tg酒精组Mallory小体检出率显著高于野生型酒精组(P＜0.05)。　　 结论：HBV表达增加酒精对肝脏损伤的程度，使HBV-Tg酒精组小鼠更易向纤维化方向发展。酒精能刺激转基因小鼠体内HBV的表达和复制，同时HBV感染增加肝脏对酒精损伤的易感性，两者的协同作用，致使小鼠容易形成肝脏慢性炎症，导致肝纤维化的发生。如果用此种方法造模花费时间长，效果不理想，若要制备出理想的小鼠肝纤维化模型，应探索其它途径和方法，如加大酒精量及浓度灌胃造模，同时给予致癌物二乙基亚硝胺(DEN)或化学药物四氯化碳(CCl4)等，以提高造模成功率及缩短造模周期。　　 第二部分：Rag-1-/-/HBV小鼠模型的培育及初步研究。　　 背景：免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)和T细胞受体(T cell receptor，TCR)库的多样性是B和T淋巴细胞在发育过程中通过variable(V)，diversity(D)和joining(J)基因重排产生的。基因重排异常将严重的影响抗原受体库多样性的产生，导致早期淋巴细胞发育被阻断而使循环中T、B细胞缺失，引起的一类严重的联合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency，SCID)，临床上统称为Omenn综合征(Omenn syndrome，OS)。不同的Omenn综合征可能代表不同类型的免疫缺陷，因淋巴特异的重组酶活性的不同而不同。而重组激活基因(Recombinationactivation gene，Rags)的编码产物Rag-1是最重要的重组酶之一，最早出现在有齿鱼，在脊椎动物的进化过程中高度保守。能特异地识别Ig和TCR的V、D和J基因片段两侧的重组信号序列(recombination signal sequences，RSS)，并催化DNA双链断裂，引起V(D)J重排，它的正确时空特异性表达对获得性免疫系统的正常发育至关重要，并受到严格的调控。Rag-1基因敲除鼠由于体内不能产生成熟的T、B淋巴细胞，因此能广泛用于免疫系统功能的研究，美国麻省理工学院Peter Mombarets博士于1991年首次成功培育出的这种新型的突变动物模型。本实验室一直进行转基因小鼠发病机制的研究，受到Jody等人的启发，我们在国内首次建立和培育出了Balb/C背景Rag-1-/-/HBV小鼠模型，为深入研究乙型肝炎免疫耐受机制和探索抗HBV治疗新药提供了更好的实验用动物模型。　　 目的：建立和培育出Balb/C背景Rag-1-/-/HBV双转基因小鼠模型，并对其进行鉴定和繁殖，观察Rag-1-/-/HBV转基因小鼠回输同遗传背景成年野生型小鼠脾淋巴细胞后，在HBV免疫应答方面的结局，为探索病毒感染持续的细胞与分子机制奠定基础。　　 方法：将我们所建立的已经传代到第三十五代的Balb/C背景的复制型HBV转基因小鼠，与同背景的Rag-1基因敲除小鼠(Rag-1-/-)杂交，筛选出表达HBsAg阳性的Rag-1-/-小鼠(Rag-1-/-/HBV)，用于实验研究和繁殖。给8w的该小鼠尾静脉回输同背景的野生型未致敏的小鼠脾淋巴细胞108进行实验，对照组尾静脉回输1×PBS0.5ml，自由进食、饮取，期间密切关注小鼠的活动状态，于不同的时间点检测小鼠血清中ALT、HBsAg、HBcAb的水平变化，行肝组织HE染色。同时在实验过程中，根据小鼠自身状态及实验结果对用于回输的脾淋巴细胞浓度、体积等免疫重建条件进行调整。　　 结果：采用70-80d雄性与雌性Rag-1-/-/HBV杂合子小鼠交配繁殖，筛选出实验所需的Rag-1-/-/HBV纯合子小鼠，将其以雌雄2∶1的比例再繁殖所得子二代用于实验研究。Rag-1纯合子既可以与纯合子，又可与杂合子小鼠繁殖，说明这种小鼠有正常的生育能力，且获得的子代基因型均符合孟德尔遗传规律。饲养在无菌环境下，肉眼观纯合子Rag-1基因突变小鼠发育正常，不能与同窝的正常小鼠区分开来。和同窝的野生型小鼠或者杂合Rag-1小鼠一样，Rag-1纯合子小鼠前肢有紧握的能力、能走直线、能听到声音、能感觉到热和痛，也能游泳，但表现的更为活跃。也就是说是Rag-1基因敲除的小鼠在空间学习和记忆上跟正常小鼠没有明显的差别。将同遗传背景的野生型小鼠脾淋巴细胞108回输给8w Rag-1-/-/HBV小鼠，同时回输0.5ml1×PBS做阴性对照，实验组Rag-1-/-/HBV小鼠血清ALT水平于回输后7天升高最明显，之后恢复到正常水平，血清能产生HBcAb，清除HBsAg。对照组Rag-1-/-/HBV小鼠ALT水平正常，产生HBcAb，不能清除外周血中的HBsAg。　　 结论：成功建立Rag-1-/-/HBV小鼠的免疫耐受模型，为研究乙肝免疫耐受机制和探索抗HBV治疗新药提供了更有针对性的动物模型。通过对此转基因小鼠的初步应用研究，将有利于我们深入研究激活肝脏免疫细胞对HBV表达、复制及清除的影响，以及对肝细胞再生与损伤的调节作用，为筛选抗HBV药物提供新靶点。