背景现代生活中冠心病已成为人类致残和致死的最重要的原因之一。目前临床上治疗冠心病的主要手段包括药物治疗、介入治疗(PTCA或PTCA+支架术)以及外科治疗(CABG)等,其目的旨在进行血运重建,恢复心肌血流灌注。但现行的血运重建术对部分难治性心肌缺血尚不能达到理想的治疗效果。近年来,随着基因治疗技术的成熟,通过基因转染促血管新生的“分子搭桥”术成为治疗心肌缺血备受关注的研究方向[11]。“分子搭桥术”,即通过促血管生长因子或基因的转染来诱导心肌新生血管形成,实现局部血运重建,改善缺血心肌的血流灌注,激活心肌梗死后的存活心肌和冬眠心肌,改善心脏功能,延缓疾病进程。心肌缺血的基因治疗包括血管新生基因的选择及基因的靶向高效转染两个部分。人血管生成素-1(hAng-1)基因翻译所表达的蛋白是在血管新生过程中产生重要作用的一类蛋白分子。其对于缺血后血管生成的作用晚于血管内皮生长因子(VEGF),但能促进血管成熟和维持血管的稳定性,拮抗VEGF引起的血管通透性增加[2]。此外,Ang-1能通过一系列细胞信号转导途径抑制细胞凋亡,改善由于心肌细胞坏死所引发的心室重构和心力衰竭[3]。若以Ang-1基因作为治疗性的外源促血管生成基因,将其转染至梗死后心肌,将有望达到治疗心肌缺血或改善心肌梗死预后的目的。血管新生的基因治疗一直以来都困扰于没有一种既能方便快捷获得,又能安全、高效并高靶向性地将促血管生成基因转染至定点部位的合适载体。能够高效携带基因并使其成功转染的病毒载体同时也具有较强的免疫原性及致突变性,而患处局部的定点注射不利于反复多次治疗,同样限制其临床应用[4]。患处体表局部超声辐照联合超声微泡造影剂因其“去空化效应”和“声致孔隙效应”可一过性改变生物细胞膜的流动性及通透性,在胞膜上形成短暂开放的小孔,从而成功将基因转运至细胞质。因此,利用临床可控、易于获得的超声微泡作为药物或基因的载体具有较好的临床应用前景。但是截至目前,超声微泡作为载体的转染效率仍较低,且经静脉注射的转染方式使得药物或基因的分布范围广泛,不仅容易引起全身系统副反应,同样会使得靶部位药物或基因浓度低下,不能达到很好的生物学效应,导致一些相关的临床预试验并不能达到动物实验中的理想效果[5]。因而如何改善超声微泡的靶向性将是这一研究领域亟待解决的问题。超声微泡作为基因转运的载体,其靶向性可以通过以下方式实现：①微泡到达靶组织后通过超声照射产生的微泡击破和声致孔隙效应使基因或药物被靶组织摄取吸收；②将组织特异性抗体或配体与微泡表面结合,从而对靶组织特异性黏附；⑧将基因包裹入微泡内或整合入外壳中,黏附至靶组织再通过超声爆破微泡而使其释放转染[6]。心肌缺血时损伤的内皮细胞过度表达多种黏附分子,以细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的增多为主,而在正常内皮细胞表面则极少表达。ICAM-1主要介导白细胞的趋化与黏附[7,8],白细胞可通过缺血心肌组织血管内皮表达的ICAM-1稳定地黏附于内皮细胞表面,加重血管内皮的损伤及局部缺血[9]。有研究表明,损伤的血管内膜可黏附大量携ICAM-1抗体的微泡,并可据此来评价缺血区域血管的损伤情况或判断脏器移植后的急性排斥反应[10,11]。因此,若将ICAM-1抗体与超声微泡造影剂连接,使微泡能特异性识别靶部位的受损血管内皮,则有望增强基因转染的靶向性,提高局部基因浓度并增强基因的局部转染效率。第一部分超声辐照联合超声微泡SonoVue介导hAng-1基因转染培养293T细胞目的：探讨超声辐照联合超声微泡造影剂SonoVue的基因转运系统在体外介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的效率。观察该载体系统对细胞生存率及基因完整性的影响。方法：构建pEGFP-C3-hAng-1质粒。293T细胞悬液分为3组进行pEGFP-C3-hAng-1的基因转染：A组(微泡+超声照射+质粒组),B组(超声照射+质粒组)及C组(对照组,每孔仅加入目的基因质粒)；转染后48h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量检测基因的转染效率,PCR及Western blot分别检测细胞转染后目的基因表达与蛋白翻译效率,台盼蓝染色检测细胞生存率；琼脂糖凝胶电泳检测超声照射载基因微泡后质粒的完整性。结果：(1)pEGFP-C3-hAng-1质粒双酶切鉴定可得到与目的条带相同大小的预期条带,hAng-1序列测定证明真核表达质粒PEGFP-C3-hAng-1构建成功。(2)在一定超声照射及微泡浓度条件下转染后48h可在荧光显微镜下观察到A组及B组转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,C组未见明显绿色荧光表达;A组绿色荧光表达量明显高于B组；流式细胞仪检测A组转染效率(22.98+2.18)%较B组(4.44+0.42)%显著提高(P<0.01),C组仅见极少量转染,转染效率为(0.12+0.04)%；A组与B组PCR检测可见hAng-1mRNA条带表达,其相对表达量分别为0.36+0.03、0.22+0.02,两组表达量差异有统计学意义(P<0.01); SDS-PAGE/Westernbolt实验显示A组及B组均可见目的蛋白表达,A组(0.57+0.04)与B组(0.32±0.02)相对表达量差异有统计学意义(P<0.01),对照组中未见明显hAng-1mRNA及蛋白表达。台盼蓝染色示三组细胞存活率分别为(81.64±1.56)%,(83.15+2.23)%,(92.93±1.64)%,A组及B组细胞存活率低于C组(P<0.01)(3)超声照射微泡与pEGFP-C3-hAng-1质粒的混悬液后琼脂糖凝胶电泳条带与正常质粒条带位置致,显示超声联合微泡载体不会导致DNA断裂,对质粒完整性无影响。结论：超声辐照联合SonoVue微泡不会影响外源性基因的完整性,并可显著提高hAng-1基因在体外培养293T细胞的转染效率。第二部分携ICAM-1抗体靶向SonoVue微泡识别体外及体内受损内皮的实验研究目的：探讨以静电吸附法制备携[CAM-1抗体的SonoVue微泡对体外培养损伤人内皮细胞ECV304及家兔心肌梗死模型缺血区血管内膜的靶向吸附能力。方法：采用静电吸附法制备携ICAM-1抗体(FITC标记)的靶向SonoVue微泡,荧光显微镜下观察不同稀释倍数及不同pH值下抗体与微泡的吸附情况,流式细胞仪检测抗体黏附效率。体外培养经IL-1p刺激后大量表达ICAM-1的人血管内皮细胞ECV304,实验分为三组：实验组(携ICAM-1抗体靶向微泡+刺激后ECV304细胞组)、正常对照组(携ICAM-1抗体靶向微泡+正常ECV304细胞组)、阴性对照组(普通微泡+刺激后ECV304细胞组),倒置荧光显微镜检测靶向微泡、普通微泡分别与损伤ECV304细胞结合能力,观察靶向微泡对正常细胞的吸附情况。构建家兔急性心肌梗死模型,梗死兔及正常兔分别静脉注射携ICAM-1抗体的靶向SonoVue微泡及普通微泡进行心肌造影后取梗死区心肌及肝、肾组织进行冰冻切片,倒置荧光显微镜下观察靶向微泡与受损血管内膜的黏附能力。结果：将ICAM-1抗体与SonoVue微泡混合孵育并相互结合后,倒置荧光显微镜显示微泡外壳可见明亮绿色荧光表达,流式细胞仪检测示以1：50体积比稀释的ICAM-1抗体对微泡黏附较好,且不改变微泡混悬液物理性质；在pH值为4.0～5.0的反应体系中ICAM-1抗体与微泡黏附率较高。体外实验中经IL-1p刺激后的ECV304细胞周边可见大量绿色荧光表达,正常对照组中仅见极少量荧光黏附,阴性对照组中未见明显绿色荧光表达。体内实验中,注射靶向微泡的梗死兔缺血区心肌组织血管内膜处可见大量绿色荧光表达,正常兔心肌组织中仅见极少量绿色荧光,注射普通微泡的梗死兔心肌组织中未见明显绿色荧光黏附。实验动物肝、肾组织内均未见明显绿色荧光表达。结论：携ICAM-1抗体靶向微泡在体外及体内均能特异性识别受损血管内皮细胞,具有良好的定位靶向作用。第三部分超声破坏携ICAM-1抗体靶向微泡定向转染hAng-1基因治疗心肌缺血目的：探讨携ICAM-1抗体的靶向SonoVue微泡定向转染hAng-1基因至家兔梗死区心肌的能力及其作为新型基因载体治疗心肌缺血的可行性。方法：结扎家兔冠状动脉左旋支制备急性前壁心肌梗死模型,随机分为5组,分别给予无处理(对照组)、注射hAng-1基因+超声辐照(U+P组)、注射普通微泡+hAng-1基因+超声辐照(U+M+B组)、注射携ICAM-1抗体含hAng-1基因靶向微泡+超声辐照(ICAM-1+UMP组)及心肌直接注射(IM组)处理。于心梗后第二天及基因转染后2周分别行二维超声心动图及心肌超声造影检查,观察室壁运动,测量舒张末期左室内径(LVEDD)及左室射血分数(LVEF),观察微泡造影剂在缺血区心肌的充填情况,计算相对造影信号强度；转染后2周,取心肌组织行伊文思蓝染色,计算梗死质量百分比；取梗死区心肌组织及肝、肾组织分别行RT-PCR、Western blot检测,比较目的基因mRNA、蛋白表达情况。免疫组织化学Ⅷ因子染色检测心肌新生微血管密度(MVD)。结果：U+M+B组、ICAM-1+UMP组及IM组基因转染后2周均可观察到LVEDD减小、LVEF显著提高(P<0.01),其中IM组及ICAM-1组之间差异无统计学意义,但均高于U+M+B组(P<0.05),而C组及U+P组均无显著变化；U+M+B组、ICAM-1+UMP组及IM组行RT-PCR及Western blot均可检测出目的基因及蛋白表达,ICAM-1+UMP组及IM组之间表达量差异无统计学意义,且均高于U+M+B组(P<0.01)；所有组别肝肾组织均未见明显hAng-1mRNA及蛋白表达。心肌组织Ⅶ[因子染色后高倍镜下显示U+M+B组、ICAM-1+UMP组及IM组均可见较多新生毛细血管,IM组及ICAM-1+UMP组毛细血管计数高于U+M+B组(P<0.01)；相对于ICAM-1+UMP组,IM组新生毛细血管计数更高(P<0.05); MCE示基因转染2周后,U+M+B组、ICAM-1+UMP组及IM组原造影剂充盈缺损节段可见造影剂充填,ICAM-1+UMP组及IM组相对造影信号强度高于U+M+P组(P<0.05),此两组之间差异无统计学意义,余两组未见明显造影剂充填。结论：携ICAM-1抗体的靶向微泡可定向转染Ang-1基因至梗死区心肌,其转染效率与目前认为最高效的心肌注射转染的效率近似,可作为新型靶向载体转染血管新生基因,改善梗死后心脏功能,增强缺血心肌血流灌注,对心肌缺血具有治疗作用。