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目的：肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）是手足口病的主要病原体之一。为深入研究EV713D聚合酶的功能及作用机制，本实验构建EV713D真核表达载体并利用串联亲和纯化技术筛选与EV713D聚合酶相互作用的宿主蛋白。方法：扩增EV71BrCr株病毒并提取RNA。利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶基因，经BamH I/EcoR I双酶切，插入真核表达载体pcDNA3.0-Flag-HA多克隆位点BamH I/EcoR I之间，构建重组质粒pcDNA3.0-3D-Flag-HA。经酶切验证及测序鉴定后，将构建成功的真核表达载体pcDNA3.0-3D-Flag-HA转染RD细胞。用免疫荧光实验检测重组载体转染效率，Western blot方法检测3D聚合酶在RD细胞中的表达。通过串联亲和纯化技术富集到与3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析,经NCBI蛋白质数据库检索筛选与3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽。采用免疫共沉淀实验和荧光共定位技术，对候选蛋白与3D聚合酶的相互作用进行验证。结果：构建EV713D真核表达载体pcDNA3.0-3D-Flag-HA后，分别将未经酶切的重组质粒和重组质粒双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，后者出现约1.4Kbp和5.5Kbp两个条带，分别与3D基因和pcDNA3.0-Flag-HA大片段的大小相符。初步证明重组质粒pcDNA3.0-3D-Flag-HA构建正确。将测序结果与GeneBank中检索到的EV71BrCr株基因序列（序列号AB204853.1）进行比对，证实3D基因已成功克隆到pcDNA3.0-Flag-HA载体中。重组质粒转染RD细胞后，免疫荧光实验显示重组质粒转染RD细胞效率约为30%，Western blot检测到转染后RD细胞中有3D聚合酶的表达。经串联亲和纯化和LC-MS分析，并进行NCBI蛋白质数据库检索，筛选出细胞周期素G1（Cyclin G1）等一系列与3D聚合酶相互作用的蛋白。经免疫共沉淀实验和荧光共定位技术验证了Cyclin G1与3D聚合酶的相互作用。结论：本实验成功构建了EV713D真核表达载体pcDNA3.0-3D-Flag-HA，并通过串联亲和纯化技术筛选到宿主细胞内与3D聚合酶相互作用的蛋白，为EV713D聚合酶的功能及作用机制研究提供了依据。