【摘 要】
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目的:纳米镍由于其卓越的物理化学性质,广泛应用于各个领域。研究发现,Ni NPs具有生殖和胚胎毒性,可在生殖器官中积聚,导致生育能力的降低。但其是否影响妊娠期滋养细胞迁移和侵袭的功能及可能机制尚不清楚。因此,本文旨在研究Ni NPs是否影响绒毛外滋养层细胞HTR-8/SVneo的迁移和侵袭,及其相关机制的研究。方法:1.用RPMI 1640基础培养基配成浓度为25μg/m L和50μg/m L的N
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFC1004300,2018YFC1004302）； 贵州省科技计划项目（黔科合后补助[2020]3002）；
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目的:纳米镍由于其卓越的物理化学性质,广泛应用于各个领域。研究发现,Ni NPs具有生殖和胚胎毒性,可在生殖器官中积聚,导致生育能力的降低。但其是否影响妊娠期滋养细胞迁移和侵袭的功能及可能机制尚不清楚。因此,本文旨在研究Ni NPs是否影响绒毛外滋养层细胞HTR-8/SVneo的迁移和侵袭,及其相关机制的研究。方法:1.用RPMI 1640基础培养基配成浓度为25μg/m L和50μg/m L的Ni NPs溶液,超声分散30 min后利用扫描电子显微镜和粒度分析,对Ni NPs进行表征。2.将细胞暴露于不同浓度的Ni NPs（0、25、50、75、100、200和400μg/m L）中24小时后,利用CCK8法检测对细胞增殖活力进行检测。3.将细胞暴露于不同浓度的Ni NPs（0、25、50、100和200μg/m L）中24小时,离心收集细胞沉淀,使用Annexin V-FITC结合液100μL重悬细胞沉淀,加入染色液后使用流式细胞仪对细胞凋亡的比例进行检测并成像。4.将细胞分别暴露于浓度为0、25、50和100μg/m L的Ni NPs中孵育24 h。用20 u L无菌移液枪头在细胞量约80%的培养皿中划出整齐的痕迹,分别在0 h和24 h后进行观察划痕愈合情况。5.将细胞接种于Transwell小室中,在上室加入200μL细胞悬液,下室加入含有20%FBS的完全培养基中,继续培养24 h后对细胞迁移能力进行分析。若进行侵袭实验,需预先加入50μL Matrigel胶置于Transwell小室中。6.将细胞分别暴露于浓度为100μg/m L的Ni NPs,10μM 740 Y-P以及联合暴露于两溶液中24小时,利用RT-PCR和Western blot检测Ni NPs对PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,MMP2细胞迁移侵袭相关基因的表达。结果:1.Ni NPs尺寸在20 nm～150 nm范围,形貌呈规则球状,有一定团聚现象。在溶液分散体系中Ni NPs的粒径范围分布在90 nm～615 nm之间,具有一定的团聚性。2.CCK-8结果显示,细胞活力随着Ni NPs浓度的增加呈现下降的趋势。细胞的增殖活力在Ni NPs浓度大于100μg/m L较对照组下降近50%。3.流式细胞术结果显示,Ni NPs浓度在100μg/ml以内时,没有观察到细胞明显的凋亡。由于高浓度大于100μg/m L时细胞出现明显凋亡,因此后续实验选择以100μg/m L浓度的Ni NPs作为实验最大浓度。4.细胞划痕愈合实验结果显示,随着Ni NPs浓度的增加,细胞的迁移距离差异无明显变化。Transwell实验结果表明,细胞的迁移和侵袭的数量随着Ni NPs浓度的增加而逐渐减少。5.Western blot和RT-PCR结果表明,暴露Ni NPs后引起PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP2的表达水平下降。6.740 Y-P激动剂可挽救暴露于Ni NPs中导致的相关基因的表达下降,并部分恢复细胞的迁移和侵袭能力。结论:暴露Ni NPs后显著影响绒毛外滋养细胞HTR-8/SVneo的迁移和侵袭能力,并使得PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP2在m RMA和蛋白水平的表达下降,PI3K激活剂能部分改善通路中相关基因的表达,并部分恢复HTR-8/SVneo的迁移和侵袭能力。因此,Ni NPs通过下调PI3K/AKT信号通路使得MMP2表达降低,从而抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭。
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