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目的:通过阻断C57BL6小鼠双侧颈总动脉制备小鼠前脑缺血再灌注模型,开放血管造成再灌注损伤后,即刻全身喷洒75%的酒精降低小鼠体温至32-34°C,实现小鼠亚低温。HE染色及TUNEL染色检测缺血再灌损伤后小鼠海马组织病理学形态且评估脑缺血后神经细胞的变性情况及低温疗效,免疫组化及western blot检测线粒体分裂依赖动力相关蛋白(Dynamin-related protein 1,Drp1)和细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)蛋白的表达。揭示缺血再灌注损伤介导线粒体分裂相关凋亡途径激活与细胞凋亡的关系,亚低温对脑缺血再灌注损伤C57BL6小鼠中线粒体凋亡途径的影响,探讨亚低温脑保护的可能机制。方法:1.实验动物分组健康清洁青年雄性C57BL6小鼠96只,周龄8-12周。采用随机数字表法,随机分为3组,每组32只(n=32):假手术组(S组)、常温脑缺血再灌注损伤组(NT组)、亚低温脑缺血再灌注损伤组(HT组)。2.实验模型的建立以及亚低温的实施所有C57BL6小鼠术前禁食8小时,饮水自如,记录体重。小鼠麻醉后,采用双侧颈总动脉两血管阻断法制备C57BL6小鼠前脑缺血再灌注模型,脑缺血15min后开放血流制造脑缺血再灌注损伤。对假手术组(S组)的小鼠只单纯分离出双侧颈总动脉,不予血管夹闭;亚低温组(HT组)于再灌注即刻向小鼠全身喷洒75%酒精行体表降温,维持直肠温度32~34℃4h后实行复温。3.实验组织样本提取及检测方法3.1 HE染色分别于再灌注后24、72h(T1-4)时,各组随机取4只小鼠,麻醉后用手术剪剪开胸廓并且于心尖处插入细针,以0.9%氯化钠灌注,再以4%多聚甲醛溶液灌流固定小鼠脑细胞,待小鼠唇色发白,全身僵直,尾巴翘起后即表示灌注成功,随后即刻断头取脑分离海马与皮质组织,用4%多聚甲醛溶液中固定标本,于4°C保存。固定石蜡包埋,苏木精染色,显微镜下观察病理学结果,HE染色法观察海马组织形态。3.2 TUNEL染色法分别于再灌注后24、72h(T1-4)时,各组随机取4只小鼠,开胸灌注固定,随后断头处死,取标本,步骤同上,用TUNEL试剂盒检测TUNEL阳性细胞,显微镜下观察TUNEL染色结果,统计TUNEL阳性细胞凋亡计数。3.3免疫组化法观察海马CA1区Drp1及Cyt C的表达各组各时间点随机取4只小鼠,同HE染色步骤,断头处死,取海马组织。用免疫组化法观察海马CA1区及皮质区Drp1蛋白及Cyt C蛋白的表达。3.4免疫印迹(Western Blot)法测定海马区Drp1及Cyt C蛋白的表达水平分别于再灌注后3,6,24、72h(T1-4)时,随机取4只小鼠,将小鼠麻醉后,冰上快速取小鼠脑的海马组织,置于冻存管内妥善密封,为防止蛋白迅速降解,必须即刻迅速放入液氮罐保存标本,-80°C冰箱做长时间保存。用免疫印迹Western Blot方法测定海马Drp1及Cyt C蛋白的表达水平。结果:1.与假手术组(S组)相比,常温缺血再灌注损伤组(NT组)HE染色显示海马CA1区锥体细胞排列形态紊乱,核固缩,胞浆深染;TUNEL阳性细胞计数明显增加(P<O.05);亚低温缺血再灌注损伤组(HT组)明显减轻脑缺血组织病理学,海马CA1区锥体细胞正常存活细胞较NT组明显增多,TUNEL阳性细胞凋亡计数明显减少,具有统计学差异(P<O.05);2.与假手术组(S组)相比,缺血再灌注损伤组(NT组)的海马区Drp1及Cyt C蛋白表达明显上调(P<0.05);与缺血再灌注损伤组(NT组)比较,亚低温缺血再灌注损伤组(HT组)海马Drp1及Cyt C蛋白表达明显下调,具有统计学差异(P<O.05)。结论:1.亚低温可以明显减轻小鼠前脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的情况,具有脑保护作用;2.常温下脑缺血再灌注损伤可促使小鼠海马线粒体分裂动力相关蛋白Drp1及细胞色素C蛋白的表达明显增加;3.亚低温可减少小鼠海马区线粒体分裂动力相关蛋白Drp1及细胞色素C蛋白的表达,减少线粒体分裂介导的凋亡途径,减轻脑损伤。