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背景:胰腺癌(PC)的一个明显特征就是多数患者都伴有胰腺癌相关糖尿病(PCDM)[15]。由于PCDM经常在PC典型症状出现前平均约13个月就表现出来,因此,PCDM是一个早期发现诊断胰腺癌的重要线索[7,8]。然而,PCDM的潜在机制仍有待阐明。最近,Skrha J等比较了健康对照组、PC和T2DM患者空腹血浆中肠促胰素的水平。相比于T2DM和正常对照,胰腺癌(DM-/DM+)患者血清的GIP水平明显降低,而当切除肿瘤后,GIP水平再次回升,这表明胰腺癌就是GIP水平下降的原因[14]。虽然该研究认为是胰腺癌分泌的某种物质抑制了 GIP的产生,但该文献未对其背后的机制做进一步探索。我们拟进一步探讨胰腺癌患者中GIP水平下降的机制。负责分泌GIP和GLP-1的K和L细胞位于肠黏膜上皮,与胰腺癌相隔较远,而外泌体是一类可以介导细胞远距间物质交流的细胞外囊泡,胰腺癌很可能通过产生外泌体的方式影响K和L细胞的功能。因此,我们设想:胰腺癌产生的外泌体作用于K或L细胞从而影响肠促胰素的产生,最终导致PCDM的发生。方法:本研究选取能分泌GIP和GLP-1的STC-1为靶细胞,并选取了两株胰腺癌细胞系PANC-1和MIA PaCa-2,以及一株大肠癌细胞系SW620等三种细胞系作为母细胞。首先,我们收集SW620、PANC-1和MIA PaCa-2细胞上清中外泌体,并对外泌体进行表征分析。接着,通过对外泌体进行荧光标记,并与STC-1细胞共孵育后观察,以明确STC-1细胞能摄取外泌体。然后,三种不同来源的外泌体分别处理STC-1细胞,通过MTT法检测了外泌体对STC-1细胞增殖功能的影响;通过ELISA和细胞免疫荧光实验评价外泌体对STC-1分泌GIP和GLP-1的影响。然后,通过qRT-PCR和Western Blot等手段分别检测STC-1细胞内的proGIP、proglucagon和1/3型枯草杆菌蛋白转化酶(PCSK1/3)、2型枯草杆菌蛋白转化酶(PCSK2)等的水平,以探讨外泌体影响GIP和GLP-1产生的具体机制。然后通过miRNA芯片比较不同细胞外泌体中miRNA表达谱的差异,并通过qRT-PCR、转染、ELISA和Western Blot等方式筛选并验证其中起关键作用的miRNA。在该研究的后半部分,我们提出假设:胰腺癌分泌的外泌体是通过胰液到达位于肠黏膜上皮的K和L细胞。我们通过收集胰腺癌复发灶累及或不累及胰腺两组病人的临床资料及空腹血糖水平记录,并尝试从胰液标本中提取外泌体。此外,在动物实验中,通过尾静脉和十二指肠降部肠腔两种途径将DiR标记的外泌体注射到裸鼠体内,然后观察外泌体的在小鼠体内的分布情况。结果:我们分离并鉴定了外泌体,三种细胞的外泌体分别简写为Exo-SW620、Exo-Pan和Exo-Mia。通过外泌体分别与STC-1细胞共孵育,不同外泌体均能够被STC-1细胞摄取,且它们对STC-1细胞增殖均没有明显的影响,但是Exo-Mia在体外能抑制STC-1细胞产生GIP和GLP-1,并呈浓度和时间依赖的方式。细胞免疫荧光的结果也证实了这一点。qRT-PCR和Western Blot实验结果证实Exo-Mia处理过的STC-1细胞内的proGip和proglucagon的mRNA表达水平是升高的,而负责proGIP和proglucagon蛋白翻译后剪切修饰的PCSK1/3的表达是下降的,这表明Exo-Mia是抑制了proGIP和proglucagon蛋白的翻译后修饰,从而抑制GIP和GLP-1的产生。miRNA芯片结果显示:相比于Exo-Pan,Exo-Mia中的miRNA有34个上调,49个下调。通过qRT-PCR,ELISA和Western Blot等实验进一步验证,发现Exo-Mia中的miRNA(miR-6796-3p、miR-6763-5p、miR-4750-3p 和 miR-197-3p)能抑制 PCSK1/3表达。此外,临床数据记录了两组胰腺癌复发患者的空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)变化情况。两组患者术前、术后的FBG水平无显著差异,术后FBG水平下降并达到最低水平;肿瘤复发时,两组的FBG水平又回升。然而,复发灶累及胰腺组的F B G水平较不累及胰腺组升高的幅度更大。我们从胰液中分离出大量的外泌体。动物实验显示通过肠腔注入的外泌体比通过血液注入的外泌体更容易被肠黏膜上皮细胞内化。结论:MI A PaCa-2的外泌体(Exo-Mia)在体外能抑制STC-1细胞产生GIP和GLP-1,并呈浓度和时间依赖的方式。Exo-Mia中的miRNA(miR-6796-3p、miR-6763-5p、miR-4750-3p和miR-197-3p)通过抑制PCSK1/3的表达进而干扰proGIP和proglucagon的翻译后剪切修饰,最终使得GIP和GLP-1产生减少。此外,临床资料及动物实验初步证明胰腺癌分泌的外泌体可能是通过胰液转运到靶细胞(肠黏膜上皮内的K及L细胞)。