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背景： 青少年特发性脊柱侧弯对青少年的身心造成严重的影响，研究其病因，探索早期诊断和新型治疗手段成为研究重点。GPR126在机体各个系统的发育中发挥重要作用。在近年的全基因组关联分析中发现GPR126上的单核苷酸多态性与青少年特发性脊柱侧弯具有相关性，且相同位点的多态性还与躯体长度相关，因此GPR126对骨骼系统发育的影响受到了研究者的关注。目前的研究发现GPR126参与软骨发育的过程，并对骨形成也有影响。研究显示GPR126在其他系统的发育中具有影响细胞—细胞间接触和电耦合的作用，而其结构特点又使GPR126能与邻近细胞、分子、细胞外基质发生相互作用，甚至远处细胞也可与GPR126被酶解的N端片段(NTF)发生相互作用，而间充质干细胞聚集是体内和体外成软骨必须的起始阶段，且对成骨也有一定的影响。因此GPR126对细胞间黏附或相互作用的影响可能是它调控间充质干细胞成软骨、成骨分化的机制。人脐带间充质干细胞具有一般间充质干细胞贴壁生长、可多向分化的特点，且采集过程无创伤、细胞活力佳、病毒感染率低、不易老化、多次传代表型不易变化、获取细胞量多等优点，因此在近些年被认为是获得间充质干细胞的优良来源。 目的： 此次研究通过慢病毒侵染构建GPR126敲低的人脐带间充质干细胞株，并按照标准的流程进行成骨和成软骨实验，以茜素红染色、阿尔新蓝染色、荧光定量PCR、免疫组织化学、Western-blot观察对照细胞和GPR126敲低细胞间成骨、成软骨的差异，探索GPR126对间充质干细胞成软骨、成骨影响的具体分子机制。 方法： 1、无菌条件下获取近胎儿端10cm脐带组织，去除脐带动静脉后将脐带切成1mm3左右小块进行贴壁培养。分离的细胞进行诱导成骨、成软骨、成脂分化。 2、合成敲低shRNA序列，与慢病毒载体酶切连接后转化感受态细菌并送菌液测序。选取阳性菌液扩大培养提取质粒，转染293FT细胞后获得病毒上清，以病毒上清侵染人脐带间充质干细胞，流式分选后继续培养，以荧光定量PCR和Western-blot检测鉴定敲低效果。 3、将对照细胞和GPR126敲低细胞分别进行成软骨、成骨诱导分化，阿尔新蓝染色、免疫组织化学检测CollagenⅡ和Aggrecan观察成软骨效果，茜素红染色、Western-blot检测碱性磷酸酶和骨钙素观察成骨效果。 4、荧光定量PCR检测成软骨团、成骨分化细胞中GPR126和黏附相关成员的mRNA表达变化，并以免疫组织化学和Western-blot检测验证蛋白表达水平的变化。 结果： 1、本次实验中获得的长梭形细胞可贴壁生长、增殖能力强，符合一般的间充质干细胞形态及培养特性，且分化实验也证明其具有成骨、成软骨、成脂分化潜能，可认为该细胞就是间充质干细胞。 2、病毒侵染分选培养后，荧光率可达80％以上，荧光定量PCR显示GPR126-shRNA1和GPR126-shRNA2细胞株的GPR126 mRNA表达水平显著低于GPR126-CON细胞株;提取膜蛋白进行Western-blot检测后发现GPR126-shRNA1和GPR126-shRNA2细胞株的GPR126蛋白表达水平显著低于GPR126-CON细胞株。说明侵染的GPR126敲低病毒确实有敲低效果。 3、GPR126-CON细胞形成的软骨团较疏松，而GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2形成的软骨团较致密。CollagenⅡ和Aggrecan在GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2细胞分化的软骨团中高表达。GPR126-CON细胞分化为成骨细胞后，钙结节红染，均匀分布在视野中，而GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2细胞成骨在成骨分化过程中有互相聚集的趋势，形成“小岛”状钙结节集合，在更高倍显微镜下可观察到钙结节密集的情况。成骨分化过程中对照组碱性磷酸酶和骨钙素表达水平高于敲低组。 4、对照组和敲低组间充质干细胞在成软骨过程中GPR126均有升高，对照组GPR126mRNA上调表达的程度显著高于敲低细胞。L-选择素mRNA表达水平在对照组和敲低组细胞成软骨、成骨分化过程中均升高，且对照组L-选择素mRNA上调表达的程度高于敲低组。对照组细胞成软骨、成骨分化后L-选择素蛋白表达水平高于敲低组。 结论： 1、应用人脐带组织贴壁法可分离得到间充质干细胞，经观察细胞形态、培养特性以及细胞多向诱导分化实验鉴定可明确为间充质干细胞; 2、构建的GPR126敲低慢病毒确实能降低GPR126的表达水平，得到2株GPR126敲低的稳转人脐带间充质干细胞; 3、GPR126功能缺失能同时影响成骨过程和成软骨过程，提示GPR126它可能参加机体内成软骨和成骨的过程; 4、L-选择素在成软骨、成骨分化过程中的变化特点类似GPR126在各组细胞间的变化情况，提示L-选择素可能是GPR126的下游因素，参与GPR126影响间充质干细胞黏附的过程，并最终影响间充质干细胞成软骨、成骨分化。