骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells-bone marrow,MSC-bm)具有较强的自我增殖、多向分化潜能、低免疫源性、易于导入外源基因以及极好的炎症、肿瘤趋向性等特点,被认为是骨伤、肿瘤、心血管疾病等领域细胞生物治疗组织工程的理想种子细胞来源。近期研究表明,干细胞生存的微环境成分及信号通路的改变,有可能诱发MSCs发生恶性转化或分化为肿瘤相关纤维母细胞(TAFs)等。因此MSCs在肿瘤微环境中安全性问题如何进一步明确并加以有效预防,已成为推广其临床应用的关键问题。目的本文通过Transwell小室建立人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells-bone marrow,HMSC-bm)与肺腺癌细胞株A549共培养体系,研究可能诱发HMSC-bm异常增殖分化的条件；观察A549共培养肿瘤微环境中HMSC-bm (CO-HMSC-bm)形态、生长、细胞周期的变化；研究CO-HMSC-bm黏附、迁移、侵袭能力及MMP-2、MMP-9蛋白表达的改变；检测CO-HMSC-bm细胞骨架、克隆增殖及多向分化性的变化；探讨CO-HMSC-bm染色体核型、癌/抑癌基因表达及ERK1/2相关信号通路的的影响；分析CO-HMSC-bm组蛋白去乙酰化酶活性(HDAC4)及组蛋白乙酰化水平等的变化,以期为MSCs的临床应用提供科学依据。方法第一部分：HMSC-bm与A549肺癌微环境共培养体系建立及条件优化研究。利用A549条件培养液孵育MSCs,同时采用6孔板结合Transwell小室建立HMSC-bm和A549细胞的共培养体系；分别以A549条件培养液孵育MSCs组、共培养]HMSC-bm组为实验组。A549条件培养液孵育MSCs组依次按25%、50%、75%、100%加入A549细胞条件培养液,培养72h后进行HMSC-bm细胞增殖活性及形态学分析；共培养组于3天、7天后终止培养,收集细胞移到培养瓶中继续培养,分别传代至第3代(P3)、第5代(P5)的细胞；另设单独培养的：HMSC-bm、A549为对照组。通过镜下观察细胞形态、MTT法分析生长曲线、流式细胞术检测周期等的变化,研究A549可能诱发MSCs异常增殖分化的条件。第二部分：A529肺癌微环境对HMSC-bm粘附、迁移、侵袭及相关分子表达的影响研究。通过细胞基质粘附实验、Transwell模型法检测共培养7d的P3、P5HMSC-bm (CO-HMSC-bm)细胞体外粘附、迁移、侵袭能力；利用Western blot及RT-PCR检测共培养7d的P5HMSC-bm (CO-HMSC-bm 7d-P5)细胞迁移相关MMP-2、MMP-9蛋白、mRNA表达的变化。第三部分：A549肺癌微环境对HMSC-bm细胞骨架、克隆增殖及多向分化性的影响研究。利用平板集落形成实验、MTT法检测细胞的增殖能力及流式细胞术检测CO-HMSC-bm 7d-P5细胞周期；采用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架；分别用成骨细胞诱导液、p-巯基乙醇诱导后,观察碱性磷酸酶的沉积、矿化结节或神经突触形成等多向分化潜力。第四部分：A549肺癌微环境对HMSC-bm染色体核型、癌／抑癌基因表达及相关信号通路的影响研究。通过倒置相差显微镜下观察CO-HMSC-bm 7d-P5细胞的形态变化；对数生长期细胞加秋水仙素作用、冰玻片滴片,Giemsa染色显带分析；提取CO-HMSC-bm 7d-P5及对照组细胞蛋白,采用Western blot技术检测抑癌基因p53、原癌基因Ras及ERK信号传导通路蛋白p-ERK、NF-κB、Capase-3蛋白的表达变化。第五部分：A549肺癌微环境对HMSC-bm组蛋白乙酰化水平的影响研究。提取CO-HMSC-bm 7d-P5及对照组细胞蛋白,采用Western blot技术检测各组细胞HDAC4及H3K9、H4K5、H4K8等乙酰化修饰位点的变化。结果HMSC-bm在25%、50%、75%、100%浓度的A549条件培养液中培养,其生长停滞,各浓度组与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。HMSC-bm与A549细胞通过Transwell小室共培养,发现随着诱导时间的延长及传代代次的增加,实验组细胞形态逐渐发生显著变化；细胞生长曲线与周期检测结果发现细胞增殖速度逐渐增快,以CO-HMSC-bm 7d组变化显著(P<0.05)。细胞迁移实验结果显示,CO-HMSC-bm 7d-P3组与A549 7d-P3组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；CO-HMSC-bm 7d-P5组与HMSC-bm 7d-P5组比较运动穿膜细胞数明显减少(P<0.05)。细胞侵袭实验结果显示,CO-HMSC-bm 7d-P3组与HMSC-bm 7d-P3组、A549 7d-P3组比较降解Matrigel胶侵袭穿膜的细胞数均增多(P<0.05)；CO-HMSC-bm 7d-P5组与HMSC-bm 7d-P5组比较降解Matrigel胶侵袭穿膜的细胞数明显减少(P<0.05)。Western blot检测MMP-2、MMP-9蛋白表达结果显示,CO-HMSC-bm 7d-P5组与HMSC-bm 7d-P5组比较显著降低(P<0.05)。RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA的表达结果显示,CO-HMSC-bm7d-P3组与MSC-bm 7d-P3组、A549 7d-P3组比较表达均升高(P<0.05)；CO-HMSC-bm 7d-P5组与HMSC-bm 7d-P5组比较表达显著降低(P<0.05)。成骨细胞、神经细胞诱导分化结果显示,HMSC-bm组具有向成骨细胞、神经细胞多向分化能力,而共培养组细胞未能被诱导分化为成骨细胞、神经细胞；细胞骨架分析HMSC-bm组细胞微丝呈现与细胞长轴方向一致的纵行排列,共培养组细胞微丝走行不规则,沿不同方向分布,可见网络状结构,与A549细胞骨架相似；共培养组细胞克隆形成率高于HMSC-bm细胞,两组间差异有统计学意义(p<0.01)；共培养组细胞增殖曲线呈S型,于第4天开始增殖速率快于HMSC-bm组；流式细胞周期检测分析共培养组处于G1期(静止期)的细胞比例低于HMSC-bm, S期(增殖期)细胞比例明显较HMSC-bm增加(p<0.05)。形态学观察,与A549细胞共培养CO-HMSC-bm 7d-P5细胞出现了细胞形态的改变,细胞缩短变小,排列紊乱,胞核大而深染,可见病理性核分裂象；染色体核型分析结果显示,对照组MSCs染色体为46,XX,二倍体；CO-MSCs染色体数目分布在46-70之间,为亚三倍体、三倍体,共培养后部分细胞中染色体数目发生了非整倍体的改变,出现了明显的染色体异常。Western blot结果显示,共培养后,与HMSC-bm组相比,CO-HMSC-bm组细胞p53、caspase 3表达量降低,Ras、p-ERK、NF-κB表达量增高(p<0.01)。乙酰化水平分析,Western blot结果显示CO-HMSC-bm 7d-P5细胞HDAC4表达明显高于HMSC-bm组(p<0.01)；与肺癌细胞A549相比,组蛋白H3K9的乙酰化水平在HMSC-bm中表达水平较高,而在肺癌微环境共培养诱导条件下明显下降(p<0.01)；H4K5的乙酰化水平在CO-HMSC-bm与HMSC-bm细胞中表达水平无显著性差异；H4K8的乙酰化水平在HMSC-bm表达水平较高,而在肺癌微环境共培养诱导条件下明显下降(p<0.01)。结论1.HMSC-bm与A549的Transwell小室共培养体系中,CO-HMSC-bm 7d-P5细胞增殖、细胞周期、形态学发生显著性变化。2.CO-HMSC-bm细胞迁移、侵袭能力及其相关蛋白表达降低,可能更有利于]HMSC-bm在肿瘤组织局部的定植。3.共培养A549微环境可诱发CO-HMSC-bm细胞骨架异常变化,出现类A549样细胞样改变；丧失了向成骨细胞、神经细胞分化的潜能；细胞克隆形成率异常增高。4.CO-HMSC-bm出现病理性核分裂象,部分细胞中染色体数目发生了非整倍体的改变,有明显的染色体异常；p53等抑癌基因及caspase 3等凋亡相关蛋白表达量降低,Ras癌基因及p-ERK、NF-κB等信号通路关键分子异常高表达可能是诱发CO-HMSC-bm遗传稳定性变化的重要分子机制之一。5. CO-HMSC-bm的HDAC4水平异常增高,组蛋白H3K9、H4K8等乙酰化修饰位关键点的乙酰化水平下降,提示组蛋白乙酰化水平的异常改变可能影响了CO-HMSC-bm细胞生物学遗传稳定性的变化。