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背景和目的:结核病是我国重大传染病之一,是严重危害我国人群健康的呼吸道传染病。本课题组前期研究发现,耐药性空洞型肺结核病人经有效手术治疗后,CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)细胞水平明显下降。CD4+CD25+Treg细胞水平上调与结核分枝杆菌感染存在高度相关性,但其产生机制并不清楚。因此我们选取结核菌分泌蛋白ESAT-6和Ag85B对人外周血进行刺激,运用流式细胞术检测外周血中CD4+CD25+Treg细胞(％PBMC),证明经蛋白刺激后CD4+CD25+Treg细胞明显升高。由于CD25在活化的T细胞(包括CD4+CD25-T细胞)中表达,而叉头样转录因子FoxP3在激活的CD4+CD25-T细胞上并不表达,是CD4+CD25+Treg细胞的特异性生物标志,其表达水平与CD4+CD25+Treg细胞数量成正相关。因CD25作为明确的Treg的生物标志受限,为了更精确的检测Treg水平,应用RT-PCR技术检测FoxP3 mRNA表达水平。本论文主要通过检测FoxP3 mRNA表达水平,从基因水平上观察经ESAT-6和Ag85B刺激后的外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞改变,为研究结核分枝杆菌诱导CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞上调产生免疫逃逸机制提供新的依据。 材料和方法: 1.对汕头市第三人民院进行结核病流行病学调查,获取痰培养和药敏试验及病人的一般信息,描述当地结核病分布情况。 2.从健康人群、潜伏期感染者、耐药性结核病病人中随机选取志愿者,对其空腹静脉取血。 3.采用不同浓度(0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml)的ESAT-6、Ag85B、ESAT-6+Ag85B、BCG处理血液,培养24h、48h、72h后,实时荧光定量PCR检测FoxP3 mRNA表达水平。 结果: 1.结核病流行病学调查发现,痰培养阳性者中男性多于女性,且男性年龄高于女性。而药敏试验中耐药性结核病所占比例偏高。 2.不同浓度ESAT-6,Ag85B刺激外周血24h、48h、72h后发现随浓度的增加,FoxP3 mRNA有升高趋势,培养24小时FoxP3 mRNA表达水平最高,后随时间延长有下降趋势,但均无统计学意义。 3.在未经分泌蛋白刺激前,三组(健康对照组、潜伏期感染组、病例组)中FoxP3 mRNA表达水平比较,病例组与潜伏期感染组高于对照组,但病例组和潜伏期感染组间比较差别无统计学意义。 4.分泌蛋白处理前后比较,经ESAT-6、Ag85B、ESAT-6+Ag85B处理后FoxP3 mRNA水平高于处理前水平(P<0.05),但BCG处理后FoxP3 mRNA略有升高,但差别无统计学意义。 5.不同蛋白处理后三组间比较发现,潜伏期感染组经抗原刺激后,FoxP3 mRNA水平高于病例组和健康对照组。病例组低于对照组,但无统计意义。 结论:目前耐药性结核病流行,迫切需要了解结核菌的免疫逃逸机制以寻找治疗办法。经体外抗原刺激外周血培养实验发现,外周血FoxP3 mRNA表达水平与ESAT-6,Ag85B存在剂量-反应关系。ESAT-6、Ag85B作为结核菌的主要分泌蛋白,意味着菌量负荷增加后可诱导FoxP3 mRNA表达水平上调。CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞是结核分枝杆菌逃避机体免疫清除过程中不可或缺的因素,故认为ESAT-6、Ag85B两种抗原可能与结核菌的免疫逃逸有关。